Методы оценки уреазной активности in vivo и in vitro и их место в диагностике инфекции Helicobacter pylori
«Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии», 2000, №2, Приложение №10, Т.X, с.37.
Корниенко Е.А., Милейко В.Е., Дмитриенко М.А., Нажиганов О.Н., Вашкевич О.В., Самокиш В.А.
Санкт-Петербургская Государственная Педиатрическая Академия,
ООО "Ама ",
ООО "Лаборатория биохимических методов", Санкт-Петербург, Россия
Одной из основных особенностей Helicobacter pylori (HP) является его высокая уреазная активность, позволяющая микробу адаптироваться в кислой среде желудка. Уреазную активность как in vivo, так и in vitro обычно измеряют по кинетике разложения мочевины:
NH3-CO-NH2 + Н2О --> 2 NH3 + СО2
Образующийся в процессе гидролиза мочевины аммиак может быть основой биохимической идентификации НР.
С целью совершенствования диагностики НР нами разработаны методы, основанные на оценке уреазной активности in vitro в биоптате: быстрый уреазный тест - ХЕЛПИЛ-тест, и in vivo в выдыхаемом воздухе - ХЕЛИК-тест.
Первый из них- быстрый уреазный тест на основе твердого пористого гигроскопичного волокнистого носителя. Тест содержит в качестве индикатора бромтимоловый синий с рН перехода от 6,0 до 7,6. Использование индикатора с несколько меньшим, чем у фенолового красного, значением рН перехода позволяет зафиксировать в реакционной среде меньшее количество свободного аммиака, а следовательно, и меньшее количество уреазы, то есть повысить чувствительность теста. Биохимическая реакция происходит на ограниченном пространстве под биоптатом и в непосредственной близости от него, что делает сопоставимым количество уреазы и реакционной среды, это также повышает чувствительность метода.
Для оценки уреазной активности биоптат, полученный в ходе эндоскопического исследования, помещают на тест-билет и в течение 3 минут наблюдают появление индикационного эффекта - синего пятна на желтом фоне.О степени уреазной активности свидетельствует как скорость появления пятна, так и его диаметр и интенсивность окраски. Окрашивание теста вокруг биоптата шириной до 1 мм расценивалось нами как 1 степень, от 1 до 2 мм - 2 степень и более 2 мм - 3 степень уреазной активности. Поскольку тест-билет обладает капиллярными сорбционными свойствами, он абсорбирует жидкость из биоптата, не окрашивая последний, поэтому биоптат может быть использован для дальнейшего гистологического или бактериологического исследования.
Результаты ХЕЛПИЛ-теста сопоставлены с гистологическими данными у 704 детей с различными формами хронической гастродуоденальной патологии и 30 детей контрольной группы (KГ), у 96 из больных - также с результатами серологического (ELISA) и бактериологического методов диагностики НР. Чувствительность теста составила 95%, специфичность - 96%. При сопоставлении с жидким уреазным тестом у 30 больных и «Де-нол»-тестом у 20, ХЕЛПИЛ-тест превосходил их по быстроте и удобству и не уступал по чувствительности. При сопоставлении степени уреазной активности, по результатам ХЕЛПИЛ-теста, и степени обсемененности НР, по результатам гистологического исследования, коэффициент корреляции составил 0,632 (р<0,05), что свидетельствует об умеренной положительной связи между этими показателями, То есть, ХЕЛПИЛ-тест не только качественно, но и количественно свидетельствует о степени обсемененности НР слизистой оболочки желудка. Возможность получения ответа в течение 3 минут, а также одновременного использования двух высокочувствительных методов диагностики (ХЕЛПИЛ-теста и гистологического метода) на одном и том же биоптате значительно повышает диагностическую информативность без необходимости проведения дополнительных биопсий.
Второй, разработанный нами метод - дыхательный ХЕЛИК-тест, основанный на оценке уреазной активности в желудке по изменению концентрации аммиака в выдыхаемом воздухе после приема пациентом порции мочевины нормального изотопного состава. Регистрация и оценка концентрации аммиака может производиться двумя способами - с помощью индикаторных трубок (ИТ) либо с помощью иондрейфового спектрометра (ИДС) с компьютерной обработкой данных. При первом способе через ИТ с помощью электромеханического отсоса прокачивают 2л воздуха из ротовой полости пациента в течение 10 мин. и оценивают концентрацию аммиака по длине окрашенного столбика в трубке, 1 мм которого соответствует концентрации 0,3 мг/м3, при втором - пациент через специальное отверстие дышит в прибор, который автоматически каждые 30 сек. регистрирует изменение концентрации аммиака на выдохе, результаты анализируются компьютером и воспроизводятся на мониторе в виде дифференциальной гистограммы, где в условных единицах указана концентрация аммиака в момент каждого измерения, эти точки соединены в виде кинетической кривой. При проведении ХЕЛИК-теста сначала любым из 2 способов измеряется фоновая концентрация аммиака натощак, затем пациент принимает строго дозированную порцию мочевины (500мг) в 20 мл дистиллированной воды, прополаскивает рот водой, после чего проводится повторное измерение концентрации аммиака аналогичным способом. Результат оценивается путем сравнения исходной (C1) и нагрузочной после приема мочевины (С2) концентраций аммиака и их разности (DС).
С целью отработки диагностических критериев разработанного нами дыхательного ХЕЛИК-теста его результаты сопоставлены с результатами гистологического исследования и уреазного ХЕЛПИЛ-теста у 500 пациентов (85 НР- и 415 НР+) и 30 детей контрольной группы (КГ), у 96 больных проведено также серологическое исследование (ELISA), у 45 - бактериологическое.
У детей контрольной группы (КГ) фоновая концентрация аммиака в воздухе ротовой полости (С1) составила 1,1±0,13 мм, после приема 500 мг карбамида (С2) - 2,4±0,2 мм, прирост концентрации (DС) - 1,3±0,15 мм. Аналогичные показатели НР- больных были близки к таковым в КГ и не имели различий в зависимости от типа гастрита. Средние показатели при HP-статусе составили: С1 - 1,38±0,1 мм, С2 - 2,85±0,15 мм, DС - 1,47±0,15мм, р>0,05. У НР+пациентов C1 составила 1,78+0,06 мм, что оказалось достоверно выше, чем в КГ (р<0,05), но не имело достоверных отличий от HP-пациентов (р>0,05). Эти данные еще раз подтверждают недостаточную информативность ранее применявшегося «Аэротеста», основанного на измерении только фоновой концентрации аммиака. После приема порции мочевины у всех НР+больных наблюдалось существенное повышение концентрации аммиака в воздухе ротовой полости, С2 составила 5,9±0,4 мм, а DС - 4,1+0,4 мм. Оба показателя достоверно превышают аналогичные у HP-больных и в КГ (р<0,05). Сравнение значений показателей ХЕЛИК-теста у пациентами с различными формами НР-ассоциированных гастродуоденальных заболеваний не выявило статистически достоверных отличий между ними (р>0,05).
Сопоставление значений С1 и С2 у каждого НР+ больного не выявило корреляции между ними (коэффициент корреляции=0,358, р>0,05), при этом обнаружена сильная положительная связь между С2 и DС, коэффициент корреляции = 0,989 (р<0,05). То есть, нарастание концентрации аммиака после приема мочевины не зависит от его исходного уровня. С другой стороны, именно прирост концентрации аммиака и ее абсолютные значения после приема мочевины отражают уреазную активность и могут служить достоверным критерием инфицированности НР.
На основании полученных данных нами отработаны нормативы ХЕЛИК-теста (ИТ): результат считается положительным, если после приема 500 мг карбамида концентрация аммиака (С2) превышает 0,9 мг/м3 (3 мм), а прирост концентрации (DС) -0,5 мг/м3 (2мм).
Сопоставление средних значений С2 в группе НР+ пациентов со средними показателями УА, рассчитанными по результатам ХЕЛПИЛ-теста, позволило установить наличие умеренной связи между ними (коэффициент корреляции = 0,762, р<0,05), сопоставление С2 со степенью обсемененности НР слизистой оболочки антрального отдела, по данным гистологического исследования, выявило сильную положительную связь (коэффициент корреляции = 0,947, р<0,05). Полученные результаты свидетельствуют о том, что ХЕЛИК-тест косвенно отражает степень заселенности НР и его уреазную активность, то есть может считаться дыхательным уреазным тестом in vivo.
При использовании другой модификации ХЕЛИК-теста - ИДС и исследовании с его помощью 184 пациентов (40 НР- и 144 НР+) и 18 детей КГ получены сходные с ИТ результаты, коэффициент корреляции значений С1, по результатам двух дыхательных методов составил 0,96, С2 - 0,90 (р<0,05).
Анализ кинетических кривых, полученных при ИДС, показал, что выделение аммиака происходит с выдыхаемым воздухом дискретно, продолжительность повышения концентрации аммиака после приема мочевины у НР+ пациентов обычно колеблется от 15 до 25 мин., а максимальный пик концентрации индивидуален, но чаще наблюдается в интервале от 4 до 12 мин. Результат ИДС, по нашим данным, считается положительным при DС, превышающей 100 ед.
Чувствительность ХЕЛИК-теста, независимо от способа регистрации аммиака (ИТ или ИДС), составила 95%. По сравнению с зарубежными углеродными тестами, ХЕЛИК-тест, обладая столь же высокой чувствительностью, требует значительно меньшего времени исследования (20 мин.), имеет несравнимо меньшую стоимость, не нуждается в приеме изотопов измененного состава и позволяет получить результат непосредственно в ходе исследования. ХЕЛИК-тест может быть использован как для первичной диагностики НР и скрининга, так и для динамического наблюдения за больным и оценки эффективности терапии.
© Copyright AMA Ltd. 2004.
NH3-CO-NH2 + Н2О --> 2 NH3 + СО2
Образующийся в процессе гидролиза мочевины аммиак может быть основой биохимической идентификации НР.
С целью совершенствования диагностики НР нами разработаны методы, основанные на оценке уреазной активности in vitro в биоптате: быстрый уреазный тест - ХЕЛПИЛ-тест, и in vivo в выдыхаемом воздухе - ХЕЛИК-тест.
Первый из них- быстрый уреазный тест на основе твердого пористого гигроскопичного волокнистого носителя. Тест содержит в качестве индикатора бромтимоловый синий с рН перехода от 6,0 до 7,6. Использование индикатора с несколько меньшим, чем у фенолового красного, значением рН перехода позволяет зафиксировать в реакционной среде меньшее количество свободного аммиака, а следовательно, и меньшее количество уреазы, то есть повысить чувствительность теста. Биохимическая реакция происходит на ограниченном пространстве под биоптатом и в непосредственной близости от него, что делает сопоставимым количество уреазы и реакционной среды, это также повышает чувствительность метода.
Для оценки уреазной активности биоптат, полученный в ходе эндоскопического исследования, помещают на тест-билет и в течение 3 минут наблюдают появление индикационного эффекта - синего пятна на желтом фоне.О степени уреазной активности свидетельствует как скорость появления пятна, так и его диаметр и интенсивность окраски. Окрашивание теста вокруг биоптата шириной до 1 мм расценивалось нами как 1 степень, от 1 до 2 мм - 2 степень и более 2 мм - 3 степень уреазной активности. Поскольку тест-билет обладает капиллярными сорбционными свойствами, он абсорбирует жидкость из биоптата, не окрашивая последний, поэтому биоптат может быть использован для дальнейшего гистологического или бактериологического исследования.
Результаты ХЕЛПИЛ-теста сопоставлены с гистологическими данными у 704 детей с различными формами хронической гастродуоденальной патологии и 30 детей контрольной группы (KГ), у 96 из больных - также с результатами серологического (ELISA) и бактериологического методов диагностики НР. Чувствительность теста составила 95%, специфичность - 96%. При сопоставлении с жидким уреазным тестом у 30 больных и «Де-нол»-тестом у 20, ХЕЛПИЛ-тест превосходил их по быстроте и удобству и не уступал по чувствительности. При сопоставлении степени уреазной активности, по результатам ХЕЛПИЛ-теста, и степени обсемененности НР, по результатам гистологического исследования, коэффициент корреляции составил 0,632 (р<0,05), что свидетельствует об умеренной положительной связи между этими показателями, То есть, ХЕЛПИЛ-тест не только качественно, но и количественно свидетельствует о степени обсемененности НР слизистой оболочки желудка. Возможность получения ответа в течение 3 минут, а также одновременного использования двух высокочувствительных методов диагностики (ХЕЛПИЛ-теста и гистологического метода) на одном и том же биоптате значительно повышает диагностическую информативность без необходимости проведения дополнительных биопсий.
Второй, разработанный нами метод - дыхательный ХЕЛИК-тест, основанный на оценке уреазной активности в желудке по изменению концентрации аммиака в выдыхаемом воздухе после приема пациентом порции мочевины нормального изотопного состава. Регистрация и оценка концентрации аммиака может производиться двумя способами - с помощью индикаторных трубок (ИТ) либо с помощью иондрейфового спектрометра (ИДС) с компьютерной обработкой данных. При первом способе через ИТ с помощью электромеханического отсоса прокачивают 2л воздуха из ротовой полости пациента в течение 10 мин. и оценивают концентрацию аммиака по длине окрашенного столбика в трубке, 1 мм которого соответствует концентрации 0,3 мг/м3, при втором - пациент через специальное отверстие дышит в прибор, который автоматически каждые 30 сек. регистрирует изменение концентрации аммиака на выдохе, результаты анализируются компьютером и воспроизводятся на мониторе в виде дифференциальной гистограммы, где в условных единицах указана концентрация аммиака в момент каждого измерения, эти точки соединены в виде кинетической кривой. При проведении ХЕЛИК-теста сначала любым из 2 способов измеряется фоновая концентрация аммиака натощак, затем пациент принимает строго дозированную порцию мочевины (500мг) в 20 мл дистиллированной воды, прополаскивает рот водой, после чего проводится повторное измерение концентрации аммиака аналогичным способом. Результат оценивается путем сравнения исходной (C1) и нагрузочной после приема мочевины (С2) концентраций аммиака и их разности (DС).
С целью отработки диагностических критериев разработанного нами дыхательного ХЕЛИК-теста его результаты сопоставлены с результатами гистологического исследования и уреазного ХЕЛПИЛ-теста у 500 пациентов (85 НР- и 415 НР+) и 30 детей контрольной группы (КГ), у 96 больных проведено также серологическое исследование (ELISA), у 45 - бактериологическое.
У детей контрольной группы (КГ) фоновая концентрация аммиака в воздухе ротовой полости (С1) составила 1,1±0,13 мм, после приема 500 мг карбамида (С2) - 2,4±0,2 мм, прирост концентрации (DС) - 1,3±0,15 мм. Аналогичные показатели НР- больных были близки к таковым в КГ и не имели различий в зависимости от типа гастрита. Средние показатели при HP-статусе составили: С1 - 1,38±0,1 мм, С2 - 2,85±0,15 мм, DС - 1,47±0,15мм, р>0,05. У НР+пациентов C1 составила 1,78+0,06 мм, что оказалось достоверно выше, чем в КГ (р<0,05), но не имело достоверных отличий от HP-пациентов (р>0,05). Эти данные еще раз подтверждают недостаточную информативность ранее применявшегося «Аэротеста», основанного на измерении только фоновой концентрации аммиака. После приема порции мочевины у всех НР+больных наблюдалось существенное повышение концентрации аммиака в воздухе ротовой полости, С2 составила 5,9±0,4 мм, а DС - 4,1+0,4 мм. Оба показателя достоверно превышают аналогичные у HP-больных и в КГ (р<0,05). Сравнение значений показателей ХЕЛИК-теста у пациентами с различными формами НР-ассоциированных гастродуоденальных заболеваний не выявило статистически достоверных отличий между ними (р>0,05).
Сопоставление значений С1 и С2 у каждого НР+ больного не выявило корреляции между ними (коэффициент корреляции=0,358, р>0,05), при этом обнаружена сильная положительная связь между С2 и DС, коэффициент корреляции = 0,989 (р<0,05). То есть, нарастание концентрации аммиака после приема мочевины не зависит от его исходного уровня. С другой стороны, именно прирост концентрации аммиака и ее абсолютные значения после приема мочевины отражают уреазную активность и могут служить достоверным критерием инфицированности НР.
На основании полученных данных нами отработаны нормативы ХЕЛИК-теста (ИТ): результат считается положительным, если после приема 500 мг карбамида концентрация аммиака (С2) превышает 0,9 мг/м3 (3 мм), а прирост концентрации (DС) -0,5 мг/м3 (2мм).
Сопоставление средних значений С2 в группе НР+ пациентов со средними показателями УА, рассчитанными по результатам ХЕЛПИЛ-теста, позволило установить наличие умеренной связи между ними (коэффициент корреляции = 0,762, р<0,05), сопоставление С2 со степенью обсемененности НР слизистой оболочки антрального отдела, по данным гистологического исследования, выявило сильную положительную связь (коэффициент корреляции = 0,947, р<0,05). Полученные результаты свидетельствуют о том, что ХЕЛИК-тест косвенно отражает степень заселенности НР и его уреазную активность, то есть может считаться дыхательным уреазным тестом in vivo.
При использовании другой модификации ХЕЛИК-теста - ИДС и исследовании с его помощью 184 пациентов (40 НР- и 144 НР+) и 18 детей КГ получены сходные с ИТ результаты, коэффициент корреляции значений С1, по результатам двух дыхательных методов составил 0,96, С2 - 0,90 (р<0,05).
Анализ кинетических кривых, полученных при ИДС, показал, что выделение аммиака происходит с выдыхаемым воздухом дискретно, продолжительность повышения концентрации аммиака после приема мочевины у НР+ пациентов обычно колеблется от 15 до 25 мин., а максимальный пик концентрации индивидуален, но чаще наблюдается в интервале от 4 до 12 мин. Результат ИДС, по нашим данным, считается положительным при DС, превышающей 100 ед.
Чувствительность ХЕЛИК-теста, независимо от способа регистрации аммиака (ИТ или ИДС), составила 95%. По сравнению с зарубежными углеродными тестами, ХЕЛИК-тест, обладая столь же высокой чувствительностью, требует значительно меньшего времени исследования (20 мин.), имеет несравнимо меньшую стоимость, не нуждается в приеме изотопов измененного состава и позволяет получить результат непосредственно в ходе исследования. ХЕЛИК-тест может быть использован как для первичной диагностики НР и скрининга, так и для динамического наблюдения за больным и оценки эффективности терапии.
© Copyright AMA Ltd. 2004.