Актуальные проблемы диагностики хеликобактериоза
«Экпериментальная и клиническая гастроэнтерология», 2009, №2, с.50
Барышникова Н.В.
Санкт-Петербургская государственная медицинская академия имени И.И. Мечникова
Хеликобактериоз — одна из наиболее серьезных проблем гастроэнтерологии в связи с тем, что распространенность инфицирования Helicobacter pylori прогрессивно возрастает, данное заболевание все чаще выявляется у людей молодого трудоспособного возраста, а также с тем, что данный микроорганизм признан канцерогеном первого порядка. Следовательно, разработка алгоритмов ранней и точной диагностики хеликобактериоза позволит улучшить качество лечения и диспансерного наблюдения данной категории пациентов. Кроме того, все большее внимание уделяется проблеме реинфекции, в связи с тем необходимо уточнение сроков проведения контрольных тестов на H. pylori для дифференцировки реинфицирования и неуспешности эрадикационной терапии.
Несмотря на то, что Маастрихтским соглашением III в качестве рекомендуемых методов диагностики H. pylori утверждены дыхательный тест с мочевиной, меченной 13С, и иммуноферментный анализ H. pylori в кале [1], существование большого количества различных методов диагностики инфекции H. pylori подтверждает постулат о том, что уникального метода, так называемого «золотого стандарта», для диагностики хеликобактериоза пока не существует. Все многообразие методов диагностики данного микроорганизма можно разделить на инвазивные (требуют проведения фиброгастродуоденоскопии) и неинвазивные (не требуют проведения фиброгастродуоденоскопии), прямые (определение собственно H. pylori) и косвенные (определение продуктов жизнедеятельности H. pylori). Основные и наиболее часто используемые методы диагностики хеликобактериоза представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Методы диагностики инфекции Helicobacter pylori
Инвазивные методы, как правило, используются при прохождении пациентом комплекса первичных диагностических мероприятий, т.к. в данном случае назначение фиброгастродуоденоскопии является обязательным. Потенциальные показания для использования неинвазивных методов несколько шире. К ним относятся скрининговое обследование взрослых, обследование детей с жалобами на периодическую абдоминальную боль, оценка успешности эрадикации, научные показания (оценка распространенности инфекции, изучение ассоциации между наличием H. pylori и экстра-пищеварительными нарушениями) [2].
Как уже упоминалось выше, ни один метод диагностики H. pylori нельзя считать универсальным. Каждый метод исследования H. pylori имеет свои преимущества и недостатки, методы различаются по чувствительности и специфичности. Во время проведения многочисленных сравнительных исследований установлено, что результаты различных методов не всегда идентичны, следовательно, чтобы избежать получения ложнонегативных или ложнопозитивных результатов, для более точной диагностики наличия инфекции необходимо использовать как минимум два метода и результат считать положительным или отрицательным при совпадении показателей обоих методов исследования. Некоторые авторы рекомендуют даже использование трех методов для того, чтобы говорить об отсутствии инфекции [3].
К наиболее достоверным методам идентификации микроорганизма традиционно относятся бактериологический, гистологический и молекулярно-генетический методы.
Бактериологический (культуральный) метод является одним из наиболее информативных и специфичных методов. Специфичность его составляет практически 100%, чувствительность более 90% [2, 4]. Основу метода составляет культивирование микроорганизма на специальных питательных средах при определенных температурных условиях. Преимуществом метода является то, что он обеспечивает возможность выделения чистой культуры H. pylori, изучения морфологических, биохимических и биологических свойств микроорганизма, определения антибиотикорезистентности возбудителя [2]. Однако у этого метода существуют и недостатки, к которым относятся: отсроченное получение результатов на 7-10 дней, трудность транспортировки материала для сохранения микроорганизма в жизнеспособном состоянии, высокие требования к условиям культивирования (определенные питательные среды, ограничение доступа кислорода), снижение эффективности выделения H. pylori в случае низкой обсемененности, при отсутствии обострения инфекции и визуальных признаков воспаления. Недостатком данного метода считается его неспособность определять кокковые формы H. pylori [5], тогда как в настоящее время в достаточно высоком проценте случаев у H. pylori-позитивных пациентов в слизистой оболочке желудка преобладают именно кокковые формы возбудителя. В широкой клинической практике данный метод не применяется. В основном он используется в научных целях или при определении резистентности H. pylori к антибиотикам в случае неэффективности терапии первой линии при планировании дальнейшего лечения [6].
Гистологический метод — наиболее объективный метод диагностики H. pylori, ведь используя именно этот метод, Warren и Marshall описали наличие спиралевидной бактерии в слизистой оболочке желудка больных активным хроническим гастритом [7]. Он позволяет обнаружить микроорганизм в гистологических препаратах слизистой оболочки желудка, определить степень обсемененности и расположение микробных тел (поверхностное, внутриэпителиальное), форму микроорганизма (вегетативную или кокковую), а также пути взаимодействия H. pylori с тканями организма человека и наличие морфологических изменений слизистой оболочки желудка, связанных с инвазией микроба (признаки воспаления, атрофия, метаплазия, дисплазия) [8]. В основе метода лежит микроскопическое морфологическое и морфометрическое исследование парафиновых срезов, окрашенных различными способами: гематоксилин-эозином, по Романовскому-Гимзе, генциан-виолетом, по Генту, толуидиновым синим, а также использование иммуногистохимического метода [2, 5]. К преимуществам этого метода диагностики относятся удобство хранения и транспортировки образцов, возможность проведения ретроспективного анализа, проведения оценки взаимосвязи между степенью обсемененности H. pylori и состоянием слизистой оболочки желудка. Недостатками метода являются длительное приготовление парафиновых срезов, некоторая субъективность в определении степени изменения слизистой оболочки желудка, невозможность отдифференцировать виды Helicobacter и тем более их генотип, возможность получения ложнонегативных результатов в связи с неправильным забором гастробиопсийного материала (биопсия только из антрального отдела желудка, скудные биоптаты, не содержащие эпителия и слизи), а также наличия участков кишечной метаплазии, погрешностей окраски [5]. Наряду с собственно гистологическим методом, может использоваться цитологическое исследование мазков со слизистой оболочки желудка, что позволяет существенно уменьшить время получения результатов анализа [2]. Существенное повышение результатов диагностики инфекции достигается при использовании иммуногистохимического метода с моноклональными антителами против H. pylori [9]. Принцип данного метода основан на высокоспецифичном связывании антител к H. pylori, которые в дальнейшем можно визуализировать с помощью химической реакции с антигенами клеточной стенки микроба. В результате прошедшей иммуногистохимической реакции только те бактериальные клетки, которые имеют антигены, специфичные для H. pylori, в том числе и кокковые формы H. pylori, будут иметь характерное окрашивание [5]. К сожалению, широкое использование данного метода ограничено из-за его высокой стоимости и технической сложности [10]. Последним достижением в области гистологического исследования является использование fluorescence in situ hybridization, позволяющий высоко точно и напрямую в залитых в парафин биоптатах определять не только наличие H. pylori, но и штаммов, резистентных к кларитромицину [11].
Молекулярно-генетический метод (полимеразная цепная реакция) является высокочувствительным и специфичным и по диагностической ценности имеет преимущества перед другими методами диагностики H. pylori, включая гистологический и курьтуральный методы [5, 12]. Преимуществами данного метода являются высокая специфичность (обеспечивается подбором праймеров, комплементарных уникальной нуклеотидной последовательности исследуемого микроорганизма), высокая чувствительность (позволяет диагностировать не только острые, но и латентные варианты инфекции, возможно выявление даже единичных бактерий), возможность определения как вегетативных (спиралевидных), так и кокковых форм H. pylori, возможность определения отдельных генов микроорганизма для оценки его патогенности, возможность определения микроорганизма в течение 5-6 часов (экспресс-метод).
Метод состоит из трех этапов: выделение ДНК из клинического образца (биоптата), амплификация специфических фрагментов ДНК, детекция продуктов амплификации. Геном H. pylori содержит около 1600 генов. На сегодняшний день полностью определена нуклеотидная последовательность у двух штаммов микроорганизма: 26695 и J.88 [13, 14]. Существует ряд генов H. pylori, роль которых в продуцировании специфических белков - факторов патогенности микроорганизма - установлена. Именно эти гены — гены острова патогенности H. pylori - определяют при проведении молекулярно-генетического исследования (таблица 2).
Таблица 2
Отдельные гены и факторы патогенности Helicobacter pylori и возможная их роль в патогенезе хеликобактериоза [15 с дополнениями]
Следует заметить, что по данным молекулярно-генетического метода можно косвенно судить о прогнозе заболеваний, ассоциированных с H. pylori. Так, например, если у пациента с язвенной болезнью выявляется микроб, содержащий 1-2 гена острова PAI H. pylori, то с высокой степенью вероятности, прогноз будет благоприятным, с другой стороны, если у молодого практически здорового человека при профилактической фиброгастродуоденоскопии выявляются воспалительно-деструктивные изменения и присутствует H. pylori, содержащий 5-6 генов острова PAI, то прогноз неблагоприятен, если своевременно не провести эрадикационную терапию. Однако не следует забывать, что, согласно Маастрихтскому консенсусу III, различие в штаммах H. pylori, содержащих разное количество и вид генов, не освобождает пациента от прохождения курса антихеликобактерной терапии.
Если говорить о неонвазивных методах диагностики H. pylori, следует уделить особое внимание дыхательным тестам, определению микроорганизма в кале и серологическому методу диагностики.
В основе работы дыхательных тестов лежит биохимический метод определения инфицированности H. pylori слизистой оболочки желудка по уреазной активности микроорганизма, а именно способности уреазы разлагать мочевину до NH4+ и HCO3- с последующим образованием из HCO3- СО2, который, попадая в кровоток, затем выделяется через легкие и может быть определен в выдыхаемом воздухе. Радиоизотопный уреазный дыхательный тест с мочевиной, меченной радиоактивным углеродом С13 или С14, считается наиболее точным для диагностики H. pylori из неинвазивных методов и известен с 1987 года [16]. Чувствительность и специфичность радиоизотопного уреазного дыхательного теста достигает 90% по данным большинства исследований, однако для данного теста в ряде случаев отмечены ложноположительные результаты по сравнению с гистологическим методом [2]. Вместе с тем способ проведения этого теста до сих пор четко не стандартизирован, а используемые реактивы достаточно дороги [2]. Возможность использования для проведения дыхательного теста детекции паров аммиака (второй метаболит гидролиза мочевины) в воздухе ротовой полости после приема обследуемым мочевины нормального изотопного состава существенно повысила частоту использования дыхательных тестов, т.к. способствовала удешевлению метода, а также повышению его безопасности, поскольку не используются радиоактивные изотопы. Согласно данному принципу в России в 1997 году ООО «АМА» (Санкт-Петербург) разработан «Хелик-тест», показатели которого не зависят от возраста и характера гастродуоденальой патологии, а свидетельствуют лишь о наличии или отсутствии H. pylori [17]. Следует заметить, что дыхательные тесты не рекомендуется проводить больным, получающим антисекреторную терапию во избежание получения ложноотрицательных результатов с учетом возможного взаимодействия соляной кислоты и аммиака [18]. Особенно актуальным считается использование дыхательных тестов у детей в связи с ограничением применения инвазивных методов диагностики H. pylori в детском возрасте.
Для определения H. pylori в кале используется иммуноферментный анализ выявления антигена H. pylori и полимеразная цепная реакция с детекцией генов острова патогенности H. pylori (ureC, cagA). Иммуноферментный анализ выявления антигена H. pylori в кале является высокочувствительным и специфичным методом и признан стандартом в диагностике H. pylori у детей и взрослых как до, так и после проведения эрадикационной терапии. Единственным ограничением широкого применения данного метода является его высокая стоимость по сравнению с другими способами диагностики H. pylori. Полимеразная цепная реакция с детекцией генов острова патогенности H. pylori — относительно новый экспериментальный метод, чувствительность и специфичность которого четко не определены.
Серологический метод диагностики основан на определении антител IgG к H. pylori и IgG к цитотоксину CagA H. pylori в крови. Данный метод показан для скрининга в популяции, для первичной диагностики инфекции H. pylori, однако мало информативен у детей в связи со слабым иммунным ответом, с помощью этого метода невозможно различить прошедшую или текущую инфекцию, следовательно, он не рекомендован для оценки эффективности эрадикации H. pylori [19, 20]. Согласно многочисленным литературным данным, оценку эффективности эрадикации следует проводить не ранее, чем через 1,5-2 месяца после окончания терапии и отдавать предпочтение неинвазивным методам исследования, если нет необходимости в проведении контрольной фиброгастродуоденоскопии, что особенно актуально в детском возрасте [2, 13, 15, 17, 18].
Как видно из вышеизложенных данных, все методы диагностики H. pylori имеют свои преимущества и недостатки, следовательно, для получения четкого представлены о наличии H. pylori в организме человека необходимо соблюдать следующие правила диагностики:
При сравнительном анализе эффективности различных методов диагностики H. pylori у взрослых больных H. pylori-ассоциированными заболеваниями, проведенном на кафедре пропедевтики внутренних болезней СПбГМА имени И.И. Мечникова, было установлено, что по данным быстрого уреазного и дыхательного теста H. pylori выявлялся у 100% пациентов, гистологическим методом определялся у 70%, методом ПЦР — у 70% больных. Получение положительных результатов уреазного теста и Хелик-теста при отрицательных — гистологического метода или ПЦР может объясняться не ложноположительными результатами, а тем, что при проведении уреазного и Хелик-теста определяются продукты жизнедеятельности H. pylori, а не сам микроорганизм, который может не попасть в биоптат, исследуемый с помощью гистологического метода или ПЦР. Кроме того, при оценке информативности методов диагностики H. pylori было выявлено, что результаты бактериологического метода в 25% случаев были отрицательными при положительных результатах других методов исследования, что связано со сложностью культивирования H. pylori, следовательно, только на данные бактериологического метода не рекомендуется ориентироваться во избежание ложноотрицательных результатов.
Обращает на себя внимание тот факт, что при проведении ПЦР ген ureC, который традиционно считается маркером наличия инфекции H. pylori, у пациентов Санкт-Петербурга определялся только в 78% случаев, что доказывает высокую изменчивость микроорганизма. Следовательно, необходимо проводить определение не только гена ureC, но и хотя бы еще одного часто встречающегося гена H. pylori, например, гена cagA или ureI, что уже внедрено в практику в некоторых европейских странах.
Также нами была проведена сравнительная оценка результатов различных методов выявления инфекции H. pylori с последующей разработкой алгоритма оптимизации диагностики хеликобактериоза.
Для этого было обследовано 135 пациентов от 17 до 72 лет с патологией верхних отделов пищеварительного тракта (37% больных язвенной болезнью, 63% - с хроническим гастродуоденитом). Пациентам проводилась фиброгастродуоденоскопия с взятием биоптатов из тела и антрального отдела желудка для верификации H. pylori следующими методами: быстрый уреазный тест, «Хелик-тест», гистологическое исследование, полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией ureC и cagA генов острова патогенности микроорганизма, бактериологическое исследование (посев биоптатов слизистой оболочки желудка для выявления роста H. pylori).
При сравнении полученных результатов было установлено, что максимальное количество положительных результатов определялось при использовании быстрого уреазного теста, минимальное количество — при посеве биоптатов (рисунок 1).
Рис. 1. Сравнительная характеристика результатов различных методов диагностики H. pylori
По оси абсцисс — методы исследования
По оси ординат — количество положительных результатов, %
Кроме того, нами был проведен корреляционный анализ в отношении совпадения показателей различных методов диагностики, на основании которого установлена корреляционная связь между результатами быстрого уреазного теста и ПЦР (ген ureC) (рисунок 2), быстрого уреазного теста и гистологического исследования (H. pylori в теле желудка) (рисунок 3), «Хелик-теста» и гистологического исследования (H. pylori в теле желудка) (рисунок 4). На основании этого можно утверждать. Что использование комбинаций этих методов будет наиболее информативно для диагностики инфекции.
Рис. 2. Корреляционная связь между результатами быстрого уреазного теста и ПЦР (ген ureC)
По оси абсцисс — результаты быстрого уреазного теста, баллы 0-3,
По оси ординат — результаты ПЦР (ген ureC) (0—отрицательный, 1—положительный)
Рис. 3. Корреляционная связь между результатами быстрого уреазного теста и гистологического исследования (H. pylori в теле желудка)
По оси абсцисс — результаты быстрого уреазного теста, баллы 0-3
По оси ординат — результаты гистологического исследования (H. pylori в теле желудка), (0-отрицательный, 1—положительный)
Рис. 4. Корреляционная связь между результатами «Хелик-теста» и гистологического исследования (H. pylori в теле желудка)
По оси абсцисс — результаты «Хелик-теста», (0—отрицательный, 1—положительный)
По оси ординат — результаты гистологического исследования (H. pylori в теле желудка), (0—отрицательный, 1—положительный)
На основании полученных данных нами были сделаны следующие выводы разработаны рекомендации:
Список литературы:
1. Maastricht-3 Guidelines for Helicobacter pylori infection // 13 United European Gastroenterology Week. — Copenhagen, 2005.
2. Hirschi A.M., Makristathis A. Methods to detect Helicobacter pylori: from culture to molecular biology // Helicobacter . – 2007. – Vol.12, suppl.2. – P.6-11.
3. Bermejo San Jose F., Boixeda de Miguel D., Gisbert J. et al. Efficacy of four widely used techniques of the diagnosis of Helicobacter pylori infection in gastric ulcer disease // Rev. Clin. Esp. – 2000. – Vol. 200. – P. 475-479.
4. Pellicano R., Smedille A., Ponzetto A. et al. How accurate is the culture of Helicobacter pylori in a clinical setting? // An appraisal. Panminevra Med. – 2005. – Vol.47, №3. – P.191-194.
5. Ильчишина Т.А. Особенности лабораторной диагностики Helicobacter pylori и клинического течения хронического гастрита и язвенной болезни при бациллярно-кокковом дисморфизме бактерии // Дис… канд.мед.наук: 14.00.46, 14.00.47. – СПб., 2008. – 136 с.
6. Fallahi G.H., Maleknejad S. Helicobacter pylori culture and antimicrobial resistance in Iran // Indian J. Pediatr. – 2007. – Vol.74, №2. – P. 127-130.
7. Warren J.R., Marshall B.J. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in chronic gastritis // Lancet. – 1983. - Vol. 1. - P. 1273-1275.
8. Сарсенбаева А.С., Игнатова Г.Л., Воротникова С.В. Методы диагностики инфекции Helicobacter pylori. Учебное пособие // Челябинск, 2005. – 50 с.
9. Wabinga H.R. Comparison of immunogistochemical and modified Giemsa stains for demonstration of Helicobacter pylori infection in an African population // Afr. Health Sci. – 2002. – Vol.2, №2. – P.52-55.
10. Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А. Практическая иммуногистохимия // СПб: ВЦЭРМ МЧС России, 2002. – 36 с.
11. Can F., Yilmaz Z., Demirbilek M. et al. Diagnosis of Helicobacter pylori infection and determination of clarithromicin resistance by fluorescence in situ hybridization from formalinfixed, paraffin-embedded gastric biopsy specimens // Can. J. Microbiol. – 2005. - №51. – P. 569-573.
12. Brooks H., Ahmed D., McConnell M., Barbezat G. Diagnosis of Helicobacter pylori infection by polymerase chain reaction: is it worth it? // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2004. – Vol.50. – P. 1-5.
13. Исаков В.А., Домарадский И.В. Хеликобактериоз. – М.: ИД Медпрактика, 2003, 412 с.
14. Gressman H., Linz B., Ghai L. et al. Gain and loss of multiple genes during the evolution of Helicobacter pylori. // PLoS Genetics, 2005, Vol. 1(4), P.0419-0428.
15. Методы диагностики хеликобактериоза: учебное пособие / И.Г. Акопян, Н.В. Барышникова, Т.М. Григорян, Ю.С. Евстратова, А.В. Козлов, И.Ю. Мельникова, В.П. Новикова, Л.П. Хорошинина, О.Ю. Хочинская; под ред. А.В. Козлова, В.П. Новиковой. – СПб.: «Издательство «Диалект», 2008. – 88 с., ил.
16. Graham D.Y., Klein P.D., Evans D.J. JR et al. Campilobacter pylori detected noninvasively by the 13C-urea breath test // Lancet. – 1987, i. – P. 1174-1177.
17. Корниенко Е.А., Милейко В.Е., Самокиш В.А., Нажиганов О.Н. Неинвазивные методы диагностики инфекции, вызванной Helicobacter pylori // Педиатрия. – 1999. - №1. – С. 37-41.
18. Корниенко Е.А., Антонов П.В., Нажиганов О.Н. и соавт. О причинах вариабельности Helicobacter pylori-ассоциированных гастродуоденальных заболеваний у детей // Русский медицинский журнал. – 2003. – Т.11, №13. – С. 782-786.
19. Кишкун А.А., Садоков В.М., Арсенин С.Л. Полимеразная цепная реакция в оценке эффективности лечения инфекции Helicobacter pylori // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2001. – Т.11, № 5. – С. 31-36.
20. Kullavanijaya P., Thong-Ngam D., Hanvivatvong O. et al. Analysis of eight different methods for detection of Helicobacter pylori infection in patients with dyspepsia // J. Gastroenterol. Hepatol. – 2004. – Vol.19. – P. 1392-1396.
Несмотря на то, что Маастрихтским соглашением III в качестве рекомендуемых методов диагностики H. pylori утверждены дыхательный тест с мочевиной, меченной 13С, и иммуноферментный анализ H. pylori в кале [1], существование большого количества различных методов диагностики инфекции H. pylori подтверждает постулат о том, что уникального метода, так называемого «золотого стандарта», для диагностики хеликобактериоза пока не существует. Все многообразие методов диагностики данного микроорганизма можно разделить на инвазивные (требуют проведения фиброгастродуоденоскопии) и неинвазивные (не требуют проведения фиброгастродуоденоскопии), прямые (определение собственно H. pylori) и косвенные (определение продуктов жизнедеятельности H. pylori). Основные и наиболее часто используемые методы диагностики хеликобактериоза представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Методы диагностики инфекции Helicobacter pylori
| Инвазивные методы | Неинвазивные методы |
| А) бактериологический метод Б) гистологический метод В) быстрый уреазный тест (Хелпил-тест) Г) молекулярно-генетический метод (полимеразная цепная реакция) — исследование биоптатов |
А) серологический метод (скрининг) Б) молекулярно-генетический метод (полимеразная цепная реакция) — исследование кала В) уреазный дыхательный тест (13С, 14С мочевина) |
| Прямые | Не прямые (косвенные) |
| А) бактериологический метод Б) гистологический метод В) молекулярно-генетический метод (полимеразная цепная реакция) — исследование биоптатов Г) молекулярно-генетический метод (полимеразная цепная реакция) — исследование кала |
А) быстрый уреазный тест (Хелпил-тест) Б) уреазный дыхательный тест (13С, 14С мочевина) В) дыхательный тест (Хелик-тест) с кинетической оценкой концентрации аммиака в воздухе полости рта после приема пациентом порции карбамида Г) серологический метод (скрининг) |
Инвазивные методы, как правило, используются при прохождении пациентом комплекса первичных диагностических мероприятий, т.к. в данном случае назначение фиброгастродуоденоскопии является обязательным. Потенциальные показания для использования неинвазивных методов несколько шире. К ним относятся скрининговое обследование взрослых, обследование детей с жалобами на периодическую абдоминальную боль, оценка успешности эрадикации, научные показания (оценка распространенности инфекции, изучение ассоциации между наличием H. pylori и экстра-пищеварительными нарушениями) [2].
Как уже упоминалось выше, ни один метод диагностики H. pylori нельзя считать универсальным. Каждый метод исследования H. pylori имеет свои преимущества и недостатки, методы различаются по чувствительности и специфичности. Во время проведения многочисленных сравнительных исследований установлено, что результаты различных методов не всегда идентичны, следовательно, чтобы избежать получения ложнонегативных или ложнопозитивных результатов, для более точной диагностики наличия инфекции необходимо использовать как минимум два метода и результат считать положительным или отрицательным при совпадении показателей обоих методов исследования. Некоторые авторы рекомендуют даже использование трех методов для того, чтобы говорить об отсутствии инфекции [3].
К наиболее достоверным методам идентификации микроорганизма традиционно относятся бактериологический, гистологический и молекулярно-генетический методы.
Бактериологический (культуральный) метод является одним из наиболее информативных и специфичных методов. Специфичность его составляет практически 100%, чувствительность более 90% [2, 4]. Основу метода составляет культивирование микроорганизма на специальных питательных средах при определенных температурных условиях. Преимуществом метода является то, что он обеспечивает возможность выделения чистой культуры H. pylori, изучения морфологических, биохимических и биологических свойств микроорганизма, определения антибиотикорезистентности возбудителя [2]. Однако у этого метода существуют и недостатки, к которым относятся: отсроченное получение результатов на 7-10 дней, трудность транспортировки материала для сохранения микроорганизма в жизнеспособном состоянии, высокие требования к условиям культивирования (определенные питательные среды, ограничение доступа кислорода), снижение эффективности выделения H. pylori в случае низкой обсемененности, при отсутствии обострения инфекции и визуальных признаков воспаления. Недостатком данного метода считается его неспособность определять кокковые формы H. pylori [5], тогда как в настоящее время в достаточно высоком проценте случаев у H. pylori-позитивных пациентов в слизистой оболочке желудка преобладают именно кокковые формы возбудителя. В широкой клинической практике данный метод не применяется. В основном он используется в научных целях или при определении резистентности H. pylori к антибиотикам в случае неэффективности терапии первой линии при планировании дальнейшего лечения [6].
Гистологический метод — наиболее объективный метод диагностики H. pylori, ведь используя именно этот метод, Warren и Marshall описали наличие спиралевидной бактерии в слизистой оболочке желудка больных активным хроническим гастритом [7]. Он позволяет обнаружить микроорганизм в гистологических препаратах слизистой оболочки желудка, определить степень обсемененности и расположение микробных тел (поверхностное, внутриэпителиальное), форму микроорганизма (вегетативную или кокковую), а также пути взаимодействия H. pylori с тканями организма человека и наличие морфологических изменений слизистой оболочки желудка, связанных с инвазией микроба (признаки воспаления, атрофия, метаплазия, дисплазия) [8]. В основе метода лежит микроскопическое морфологическое и морфометрическое исследование парафиновых срезов, окрашенных различными способами: гематоксилин-эозином, по Романовскому-Гимзе, генциан-виолетом, по Генту, толуидиновым синим, а также использование иммуногистохимического метода [2, 5]. К преимуществам этого метода диагностики относятся удобство хранения и транспортировки образцов, возможность проведения ретроспективного анализа, проведения оценки взаимосвязи между степенью обсемененности H. pylori и состоянием слизистой оболочки желудка. Недостатками метода являются длительное приготовление парафиновых срезов, некоторая субъективность в определении степени изменения слизистой оболочки желудка, невозможность отдифференцировать виды Helicobacter и тем более их генотип, возможность получения ложнонегативных результатов в связи с неправильным забором гастробиопсийного материала (биопсия только из антрального отдела желудка, скудные биоптаты, не содержащие эпителия и слизи), а также наличия участков кишечной метаплазии, погрешностей окраски [5]. Наряду с собственно гистологическим методом, может использоваться цитологическое исследование мазков со слизистой оболочки желудка, что позволяет существенно уменьшить время получения результатов анализа [2]. Существенное повышение результатов диагностики инфекции достигается при использовании иммуногистохимического метода с моноклональными антителами против H. pylori [9]. Принцип данного метода основан на высокоспецифичном связывании антител к H. pylori, которые в дальнейшем можно визуализировать с помощью химической реакции с антигенами клеточной стенки микроба. В результате прошедшей иммуногистохимической реакции только те бактериальные клетки, которые имеют антигены, специфичные для H. pylori, в том числе и кокковые формы H. pylori, будут иметь характерное окрашивание [5]. К сожалению, широкое использование данного метода ограничено из-за его высокой стоимости и технической сложности [10]. Последним достижением в области гистологического исследования является использование fluorescence in situ hybridization, позволяющий высоко точно и напрямую в залитых в парафин биоптатах определять не только наличие H. pylori, но и штаммов, резистентных к кларитромицину [11].
Молекулярно-генетический метод (полимеразная цепная реакция) является высокочувствительным и специфичным и по диагностической ценности имеет преимущества перед другими методами диагностики H. pylori, включая гистологический и курьтуральный методы [5, 12]. Преимуществами данного метода являются высокая специфичность (обеспечивается подбором праймеров, комплементарных уникальной нуклеотидной последовательности исследуемого микроорганизма), высокая чувствительность (позволяет диагностировать не только острые, но и латентные варианты инфекции, возможно выявление даже единичных бактерий), возможность определения как вегетативных (спиралевидных), так и кокковых форм H. pylori, возможность определения отдельных генов микроорганизма для оценки его патогенности, возможность определения микроорганизма в течение 5-6 часов (экспресс-метод).
Метод состоит из трех этапов: выделение ДНК из клинического образца (биоптата), амплификация специфических фрагментов ДНК, детекция продуктов амплификации. Геном H. pylori содержит около 1600 генов. На сегодняшний день полностью определена нуклеотидная последовательность у двух штаммов микроорганизма: 26695 и J.88 [13, 14]. Существует ряд генов H. pylori, роль которых в продуцировании специфических белков - факторов патогенности микроорганизма - установлена. Именно эти гены — гены острова патогенности H. pylori - определяют при проведении молекулярно-генетического исследования (таблица 2).
Таблица 2
Отдельные гены и факторы патогенности Helicobacter pylori и возможная их роль в патогенезе хеликобактериоза [15 с дополнениями]
| Ген | Фактор патогенности (белок) | Свойства факторов патогенности |
| cagA (cytotoxin-associated gene) |
CagA | Цитотоксин, маркер «острова патогенности» H. pylori, участвует в ремоделировании тканей, ангиогенезе, язвообразовании, развитии атрофии, в процессе деградации и разрушения межклеточного матрикса и базальной мембраны, опухолевой инвазии и метастазировании посредством индукции комплекса uPA (urokinase-type plasminogen activator) и uPAR (urokinase-type plasminogen activator receptor) в раковые клетки в желудке, стимуляции выработки интерлейкина-8, способствует повышению активности антрального гастрита |
| cagC, cagE (cytotoxin-associated gene) |
CagC, CagЕ | Цитотоксины, стимулируют выработку интерлейкина-8 |
| cagH (cytotoxin-associated gene) |
CagH | Цитотоксин, маркер интактного острова патогенности, стимулирует выработку интерлейкина-8 |
| cagF (cytotoxin-associated gene) |
CagF | Цитотоксин, вовлечен в процесс распознавания и доставки CagA в каналы Т4СС (IV секреторной системы) |
| vacA (vacuolating-associated cytotoxin) |
VacA | Цитотоксин, фактор адгезии, увеличивает проницаемость мембран по отношению к анионам, достоверно уменьшает скорость реэпителизации экспериментальных язв и пролиферацию эпителиоцитов за счет нарушения функции клетки, связанных с целостностью ее цитоскелета, пассивный транспорт мочевины через эпителиальные клетки желудка, влияет на выживание H. pylori в клетках хозяина, снижает содержание АТФ в эпителиоцитах, стимулирует апоптоз клеток |
| babA1, babA2 (blood group antigen-binding adhesion) |
BabA1, BabA2 | Фактор адгезии, рецептор клеток Lewis, предположительно связан с более высокой частотой развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, осложнений инфекции H. pylori, а также с аденокарциномой желудка (BabA2) |
| oipA (outer inflammatory protein) |
OipA | Поддерживает воспаление СОЖ, связан с секрецией интерлейкина-8 и интерлейкина-6, со степенью обсемененности H. pylori СОЖ, выраженностью нейтрофильной инфильтрацией, с развитием интерстициальной метаплазии |
| sabA (sialic acid-binding adhesin) |
SabA | Поддерживает воспаление, способствует персистенции инфекции H. pylori |
| iceA1, iceA2 (induced by contact with epithelium) |
IceA1, IceA2 | Фактор адгезии |
| flaA,fla B (flagellin A- and B-subunit) |
FlaA, FlaВ | Обеспечивают подвижность |
| ure A, ureB, ure C, ureI | Уреаза (UreA, UreB, UreC, UreI) | Является собственно маркером инфекции H. pylori и фактором защиты микроорганизма от действия соляной кислоты, обеспечивает длительное персистирование H. pylori в желудке человека, усиливает воспалительные реакции посредством активации моноцитов, нейтрофилов, секреции цитокинов, образования свободных радикалов и окиси азота. Считается, что большая субъединица уреазы — UreB — действует как аттрактант для лейкоцитов |
| hopQ, hopP, hopZ (HP outer membrane protein) |
HopQ, HopP, HopZ | Обеспечивает колонизацию и обсемененность слизистой оболочки желудка |
| hpaA (adhesion gene of Helicobacter pylori) |
HpaA | Фактор адгезии |
| napA (neutrophil-activating protein) |
NapA | Активатор окислительного стресса, способен индуцировать процесс освобождения свободных радикалов в нейтрофилах, что приводит к повреждению СОЖ человека |
| rdxA (oxygen-insensitive NADPH nitroreductase), frxA (NADPH flavin oxidoreductase), fdxB (ferredoxin-like protein) |
RdxA, FrxA, FdxB | ферменты окислительного метаболизма, участвуют в формировании резистентности к метронидазолу |
| 23S rRNA | Точечные мутации A2144G, A2143G, A2143C, A2115C, A2142G, C2182T, T2717C и др. | участвуют в формировании резистентности к кларитромицину |
| sodB | Супероксидисмутаза | Позволяет H. pylori подавлять иммунный ответ организма хозяина, катализируя реакцию превращения бактерицидных соединений кислорода, высвобождаемых активированными в результате инфекции нейтрофилами, в кислород и воду, являющиеся безвредными для микроба |
| kat | Каталаза | Позволяет H. pylori подавлять иммунный ответ организма хозяина, катализируя реакцию превращения бактерицидных соединений кислорода, высвобождаемых активированными в результате инфекции нейтрофилами, в кислород и воду, являющиеся безвредными для микроба |
Следует заметить, что по данным молекулярно-генетического метода можно косвенно судить о прогнозе заболеваний, ассоциированных с H. pylori. Так, например, если у пациента с язвенной болезнью выявляется микроб, содержащий 1-2 гена острова PAI H. pylori, то с высокой степенью вероятности, прогноз будет благоприятным, с другой стороны, если у молодого практически здорового человека при профилактической фиброгастродуоденоскопии выявляются воспалительно-деструктивные изменения и присутствует H. pylori, содержащий 5-6 генов острова PAI, то прогноз неблагоприятен, если своевременно не провести эрадикационную терапию. Однако не следует забывать, что, согласно Маастрихтскому консенсусу III, различие в штаммах H. pylori, содержащих разное количество и вид генов, не освобождает пациента от прохождения курса антихеликобактерной терапии.
Если говорить о неонвазивных методах диагностики H. pylori, следует уделить особое внимание дыхательным тестам, определению микроорганизма в кале и серологическому методу диагностики.
В основе работы дыхательных тестов лежит биохимический метод определения инфицированности H. pylori слизистой оболочки желудка по уреазной активности микроорганизма, а именно способности уреазы разлагать мочевину до NH4+ и HCO3- с последующим образованием из HCO3- СО2, который, попадая в кровоток, затем выделяется через легкие и может быть определен в выдыхаемом воздухе. Радиоизотопный уреазный дыхательный тест с мочевиной, меченной радиоактивным углеродом С13 или С14, считается наиболее точным для диагностики H. pylori из неинвазивных методов и известен с 1987 года [16]. Чувствительность и специфичность радиоизотопного уреазного дыхательного теста достигает 90% по данным большинства исследований, однако для данного теста в ряде случаев отмечены ложноположительные результаты по сравнению с гистологическим методом [2]. Вместе с тем способ проведения этого теста до сих пор четко не стандартизирован, а используемые реактивы достаточно дороги [2]. Возможность использования для проведения дыхательного теста детекции паров аммиака (второй метаболит гидролиза мочевины) в воздухе ротовой полости после приема обследуемым мочевины нормального изотопного состава существенно повысила частоту использования дыхательных тестов, т.к. способствовала удешевлению метода, а также повышению его безопасности, поскольку не используются радиоактивные изотопы. Согласно данному принципу в России в 1997 году ООО «АМА» (Санкт-Петербург) разработан «Хелик-тест», показатели которого не зависят от возраста и характера гастродуоденальой патологии, а свидетельствуют лишь о наличии или отсутствии H. pylori [17]. Следует заметить, что дыхательные тесты не рекомендуется проводить больным, получающим антисекреторную терапию во избежание получения ложноотрицательных результатов с учетом возможного взаимодействия соляной кислоты и аммиака [18]. Особенно актуальным считается использование дыхательных тестов у детей в связи с ограничением применения инвазивных методов диагностики H. pylori в детском возрасте.
Для определения H. pylori в кале используется иммуноферментный анализ выявления антигена H. pylori и полимеразная цепная реакция с детекцией генов острова патогенности H. pylori (ureC, cagA). Иммуноферментный анализ выявления антигена H. pylori в кале является высокочувствительным и специфичным методом и признан стандартом в диагностике H. pylori у детей и взрослых как до, так и после проведения эрадикационной терапии. Единственным ограничением широкого применения данного метода является его высокая стоимость по сравнению с другими способами диагностики H. pylori. Полимеразная цепная реакция с детекцией генов острова патогенности H. pylori — относительно новый экспериментальный метод, чувствительность и специфичность которого четко не определены.
Серологический метод диагностики основан на определении антител IgG к H. pylori и IgG к цитотоксину CagA H. pylori в крови. Данный метод показан для скрининга в популяции, для первичной диагностики инфекции H. pylori, однако мало информативен у детей в связи со слабым иммунным ответом, с помощью этого метода невозможно различить прошедшую или текущую инфекцию, следовательно, он не рекомендован для оценки эффективности эрадикации H. pylori [19, 20]. Согласно многочисленным литературным данным, оценку эффективности эрадикации следует проводить не ранее, чем через 1,5-2 месяца после окончания терапии и отдавать предпочтение неинвазивным методам исследования, если нет необходимости в проведении контрольной фиброгастродуоденоскопии, что особенно актуально в детском возрасте [2, 13, 15, 17, 18].
Как видно из вышеизложенных данных, все методы диагностики H. pylori имеют свои преимущества и недостатки, следовательно, для получения четкого представлены о наличии H. pylori в организме человека необходимо соблюдать следующие правила диагностики:
- Использование 2-х и более методов диагностики H. pylori
- Использование сочетания методов из разных групп: инвазивный+неинвазивный, прямой+непрямой для первичной диагностики H. pylori
- Использование метода ПЦР как наиболее точного для диагностики H. pylori, а также для определения молекулярно-генетических особенностей микроорганизма для оценки его вирулентности, формирования представления о дальнейшем течении и прогнозе заболевания
- Использование для контроля эрадикации H. pylori преимущественно неинвазивных методов не ранее, чем через 1,5-2 месяца после окончания терапии.
При сравнительном анализе эффективности различных методов диагностики H. pylori у взрослых больных H. pylori-ассоциированными заболеваниями, проведенном на кафедре пропедевтики внутренних болезней СПбГМА имени И.И. Мечникова, было установлено, что по данным быстрого уреазного и дыхательного теста H. pylori выявлялся у 100% пациентов, гистологическим методом определялся у 70%, методом ПЦР — у 70% больных. Получение положительных результатов уреазного теста и Хелик-теста при отрицательных — гистологического метода или ПЦР может объясняться не ложноположительными результатами, а тем, что при проведении уреазного и Хелик-теста определяются продукты жизнедеятельности H. pylori, а не сам микроорганизм, который может не попасть в биоптат, исследуемый с помощью гистологического метода или ПЦР. Кроме того, при оценке информативности методов диагностики H. pylori было выявлено, что результаты бактериологического метода в 25% случаев были отрицательными при положительных результатах других методов исследования, что связано со сложностью культивирования H. pylori, следовательно, только на данные бактериологического метода не рекомендуется ориентироваться во избежание ложноотрицательных результатов.
Обращает на себя внимание тот факт, что при проведении ПЦР ген ureC, который традиционно считается маркером наличия инфекции H. pylori, у пациентов Санкт-Петербурга определялся только в 78% случаев, что доказывает высокую изменчивость микроорганизма. Следовательно, необходимо проводить определение не только гена ureC, но и хотя бы еще одного часто встречающегося гена H. pylori, например, гена cagA или ureI, что уже внедрено в практику в некоторых европейских странах.
Также нами была проведена сравнительная оценка результатов различных методов выявления инфекции H. pylori с последующей разработкой алгоритма оптимизации диагностики хеликобактериоза.
Для этого было обследовано 135 пациентов от 17 до 72 лет с патологией верхних отделов пищеварительного тракта (37% больных язвенной болезнью, 63% - с хроническим гастродуоденитом). Пациентам проводилась фиброгастродуоденоскопия с взятием биоптатов из тела и антрального отдела желудка для верификации H. pylori следующими методами: быстрый уреазный тест, «Хелик-тест», гистологическое исследование, полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией ureC и cagA генов острова патогенности микроорганизма, бактериологическое исследование (посев биоптатов слизистой оболочки желудка для выявления роста H. pylori).
При сравнении полученных результатов было установлено, что максимальное количество положительных результатов определялось при использовании быстрого уреазного теста, минимальное количество — при посеве биоптатов (рисунок 1).
Рис. 1. Сравнительная характеристика результатов различных методов диагностики H. pylori
По оси абсцисс — методы исследования
По оси ординат — количество положительных результатов, %
Кроме того, нами был проведен корреляционный анализ в отношении совпадения показателей различных методов диагностики, на основании которого установлена корреляционная связь между результатами быстрого уреазного теста и ПЦР (ген ureC) (рисунок 2), быстрого уреазного теста и гистологического исследования (H. pylori в теле желудка) (рисунок 3), «Хелик-теста» и гистологического исследования (H. pylori в теле желудка) (рисунок 4). На основании этого можно утверждать. Что использование комбинаций этих методов будет наиболее информативно для диагностики инфекции.
Рис. 2. Корреляционная связь между результатами быстрого уреазного теста и ПЦР (ген ureC)
По оси абсцисс — результаты быстрого уреазного теста, баллы 0-3,
По оси ординат — результаты ПЦР (ген ureC) (0—отрицательный, 1—положительный)
Рис. 3. Корреляционная связь между результатами быстрого уреазного теста и гистологического исследования (H. pylori в теле желудка)
По оси абсцисс — результаты быстрого уреазного теста, баллы 0-3
По оси ординат — результаты гистологического исследования (H. pylori в теле желудка), (0-отрицательный, 1—положительный)
Рис. 4. Корреляционная связь между результатами «Хелик-теста» и гистологического исследования (H. pylori в теле желудка)
По оси абсцисс — результаты «Хелик-теста», (0—отрицательный, 1—положительный)
По оси ординат — результаты гистологического исследования (H. pylori в теле желудка), (0—отрицательный, 1—положительный)
На основании полученных данных нами были сделаны следующие выводы разработаны рекомендации:
- Получение положительных результатов уреазного теста и «Хелик-теста» при отрицательных — гистологического метода или ПЦР может объясняться не ложноположительными результатами, а тем, что при проведении уреазного и «Хелик-теста» определяются продукты жизнедеятельности H. pylori, а не сам микроорганизм, который может не попасть в биоптат, исследуемый с помощью гистологического метода или ПЦР.
- «Хелик-тест» рекомендуется как точный неинвазивный метод при проведении оценки эффективности эрадикационной терапии, особенно в детском возрасте.
- Для повышения точности диагностики хеликобактериоза рекомендуется использовать как минимум два, а лучше три, метода исследования, предпочтительно сочетание быстрого уреазного теста или «Хелик-теста» с гистологическим методом исследования (биоптат из тела желудка) или ПЦР (детекция гена ureC).
Список литературы:
1. Maastricht-3 Guidelines for Helicobacter pylori infection // 13 United European Gastroenterology Week. — Copenhagen, 2005.
2. Hirschi A.M., Makristathis A. Methods to detect Helicobacter pylori: from culture to molecular biology // Helicobacter . – 2007. – Vol.12, suppl.2. – P.6-11.
3. Bermejo San Jose F., Boixeda de Miguel D., Gisbert J. et al. Efficacy of four widely used techniques of the diagnosis of Helicobacter pylori infection in gastric ulcer disease // Rev. Clin. Esp. – 2000. – Vol. 200. – P. 475-479.
4. Pellicano R., Smedille A., Ponzetto A. et al. How accurate is the culture of Helicobacter pylori in a clinical setting? // An appraisal. Panminevra Med. – 2005. – Vol.47, №3. – P.191-194.
5. Ильчишина Т.А. Особенности лабораторной диагностики Helicobacter pylori и клинического течения хронического гастрита и язвенной болезни при бациллярно-кокковом дисморфизме бактерии // Дис… канд.мед.наук: 14.00.46, 14.00.47. – СПб., 2008. – 136 с.
6. Fallahi G.H., Maleknejad S. Helicobacter pylori culture and antimicrobial resistance in Iran // Indian J. Pediatr. – 2007. – Vol.74, №2. – P. 127-130.
7. Warren J.R., Marshall B.J. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in chronic gastritis // Lancet. – 1983. - Vol. 1. - P. 1273-1275.
8. Сарсенбаева А.С., Игнатова Г.Л., Воротникова С.В. Методы диагностики инфекции Helicobacter pylori. Учебное пособие // Челябинск, 2005. – 50 с.
9. Wabinga H.R. Comparison of immunogistochemical and modified Giemsa stains for demonstration of Helicobacter pylori infection in an African population // Afr. Health Sci. – 2002. – Vol.2, №2. – P.52-55.
10. Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А. Практическая иммуногистохимия // СПб: ВЦЭРМ МЧС России, 2002. – 36 с.
11. Can F., Yilmaz Z., Demirbilek M. et al. Diagnosis of Helicobacter pylori infection and determination of clarithromicin resistance by fluorescence in situ hybridization from formalinfixed, paraffin-embedded gastric biopsy specimens // Can. J. Microbiol. – 2005. - №51. – P. 569-573.
12. Brooks H., Ahmed D., McConnell M., Barbezat G. Diagnosis of Helicobacter pylori infection by polymerase chain reaction: is it worth it? // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2004. – Vol.50. – P. 1-5.
13. Исаков В.А., Домарадский И.В. Хеликобактериоз. – М.: ИД Медпрактика, 2003, 412 с.
14. Gressman H., Linz B., Ghai L. et al. Gain and loss of multiple genes during the evolution of Helicobacter pylori. // PLoS Genetics, 2005, Vol. 1(4), P.0419-0428.
15. Методы диагностики хеликобактериоза: учебное пособие / И.Г. Акопян, Н.В. Барышникова, Т.М. Григорян, Ю.С. Евстратова, А.В. Козлов, И.Ю. Мельникова, В.П. Новикова, Л.П. Хорошинина, О.Ю. Хочинская; под ред. А.В. Козлова, В.П. Новиковой. – СПб.: «Издательство «Диалект», 2008. – 88 с., ил.
16. Graham D.Y., Klein P.D., Evans D.J. JR et al. Campilobacter pylori detected noninvasively by the 13C-urea breath test // Lancet. – 1987, i. – P. 1174-1177.
17. Корниенко Е.А., Милейко В.Е., Самокиш В.А., Нажиганов О.Н. Неинвазивные методы диагностики инфекции, вызванной Helicobacter pylori // Педиатрия. – 1999. - №1. – С. 37-41.
18. Корниенко Е.А., Антонов П.В., Нажиганов О.Н. и соавт. О причинах вариабельности Helicobacter pylori-ассоциированных гастродуоденальных заболеваний у детей // Русский медицинский журнал. – 2003. – Т.11, №13. – С. 782-786.
19. Кишкун А.А., Садоков В.М., Арсенин С.Л. Полимеразная цепная реакция в оценке эффективности лечения инфекции Helicobacter pylori // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2001. – Т.11, № 5. – С. 31-36.
20. Kullavanijaya P., Thong-Ngam D., Hanvivatvong O. et al. Analysis of eight different methods for detection of Helicobacter pylori infection in patients with dyspepsia // J. Gastroenterol. Hepatol. – 2004. – Vol.19. – P. 1392-1396.
© Copyright Helicobacter.ru 2009.