Определяют ли факторы вирулентности H.pylori характер гастродуоденальной патологии?
«Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии», 2001, №2, Приложение №13, Т.XI, с.74.
С.З. Чуков, В.Д. Пасечников, Ставропольская государственная медицинская академия
Введение.
Helicobacter pylori (H.pylori) является общепризнанным этиологическим агентом гастрита и пептической язвы и главным фактором риска развития желудочных аденокарцином и МАLТлимфом. Способность H.pylori обусловливать развитие перечисленных заболеваний зависит от факторов, относящихся к самому микроорганизму, организму хозяина и окружающей среде. Бактериальные факторы, обеспечивающие колонизацию слизистой оболочки желудка (СОЖ) H.pylori, включают уреазу, жгутики, адгезины, альфа-глутамилтранспептидазу. Липополисахариды, уреаза и вакуолизирующий цитотоксин являются факторами, обеспечивающими возможность H.pylori персистировать в организме хозяина в течение десятилетий и вызывать интенсивный воспалительный ответ, ведущий к повреждению клеток хозяина.
Патогенез H.pylori - инфекции у людей может быть представлен в виде трех этапов [1]:
1) поступление в просвет желудка, прикрепление к эпителию, колонизация СОЖ;
2) ускользание от иммунного ответа, нарушение или использование иммунной системы организма хозяина;
3) размножение, повреждение ткани, передача новому хозяину или распространение на соседние органы.
Фактор вирулентности определяется своим участием в одном или нескольких из этих процессов [1,2]. В настоящее время идентифицирован ряд факторов вирулентности H.pylori, включая бактериальные гены cagA, vacA, iceA. Однако, с другой стороны, накоплены убедительные данные о том, что ни один из этих факторов не имеет специфической связи с развитием определенного заболевания. Общепризнанно, что воспалительный ответ в СОЖ является ключом к пониманию механизмов, ведущих к развитию тяжелых заболеваний, ассоциированных с Н.pylori-инфекцией. Любой фактор, приводящий к усилению воспалительного ответа в СОЖ, может усиливать риск тяжелых последствий инфицирования.
Гены H.pylori в составе так называемого "островка патогенности" cag (cagA pathogenicity island, cag PAI) причастны к развитию воспалительного ответа путем инициации каскада сигнальных трансдукций, приводящего к продукции интерлейкина (ИЛ)-8. Ответная выработка провоспалительных цитокинов и клеточный (Th-1 - опосредованный) ответ приводят к дальнейшему прогрессированию воспалительной реакции. Активность ферментов NO-синтетазы (iNOS) и циклооксигеназы может нарушать баланс между процессами апоптоза желудочных эпителиоцитов и их пролиферацией, способствуя в первом случае изъязвлению СОЖ, а во втором - развитию опухолей. Th-1 - ответ организма хозяина и выработка анти-H.pylori антител не способствуют элиминации возбудителя, что вызывает проблемы при разработке иммунологических методов лечения и профилактики обсуждаемой патологии.
Несколько лет назад было высказано предположение, что плотность cagA (+) штаммов H.pylori в СОЖ значительно превышает плотность cagA (-) штаммов (4), и что различия в интенсивности воспалительной реакции, вызванной этими штаммами, в основном обусловлены разной степенью обсемененности СОЖ. В этом исследовании не проводилось сопоставление воспалительной реакции и клинических проявлений, и последующее изучение пациентов с Н.pylori-ассоциированным гастритом показало, что не существует различий в плотности обсемененности между cagA (+) и cagA (-) -штаммами (5). Напротив, плотность обсемененности антральной СОЖ при Н.pylori-ассоциированной язвенной болезни 12-перстной кишки (ЯДК) значительно выше, чем при антральном гастрите. В упомянутом исследовании Atherton и соавт (4) большинство cagA (+) штаммов H.pylori были изолированы от пациентов с ЯДК, что дало основание предположить, что высокая плотность обсемененности cagA (+) штаммов обусловлена самим заболеванием, а не cagA - статусом. Yamaoka Y., et al. (5) установили, что обсемененность cagA (+) H.pylori в теле желудка была ниже при ЯДК, чем при гастрите, следовательно, критическим фактором для колонизации СОЖ H.pylori могут оказаться факторы организма хозяина, вероятнее всего, кислотная секреция. Те же авторы исследовали продукцию ИЛ-8 у пациентов с ЯДК в сравнении с пациентами, страдавшими только гастритом. Средняя концентрация ИЛ-8 в антральном отделе желудка оказалась выше у пациентов с ЯДК. Однако при сравнительной оценке числа микроорганизмов продукция ИЛ-8 оказалась одинаковой, независимо от вида патологии, как in vivo, так и in vitro.
В генетических исследованиях показано участие генов cag PAI в индукции секреции ИЛ-8 человеческими клетками, колонизированными Н.pylori. Этот феномен может быть обусловлен провоспалительными свойствами штамма, а, следовательно, его вирулентностью. Штаммы Н.pylori, индуцирующие секрецию ИЛ-8, действительно ассоциируются с наличием гена cagA и тяжелой патологии, хотя недавно эти данные были оспорены (9,10). При изучении cag PAI оказалось, что его неоднородность касается не только структурной организации, но и функциональной активности. В отношении повреждения СОЖ это проявляется, прежде всего, неодинаковым участием компонентов cag PAI в индукции образования ИЛ-8. Li et al. [8] обнаружили, что гены левой половины PAI (гомологи генов virB9, virBlO, и virBll, описанных у микроорганизмов рода Agrobacterium) аннулировали индукцию ИЛ-8. Индукция ИЛ-8 устраняется при нарушении структуры генов cag PAI: cagE, G, H, I, L, M. В то же время cagA, cagF, cagN, по данным авторов, не являются необходимыми для индукции ИЛ-8.
Точечные мутации большинства генов обсуждаемого региона (за исключением cagA и cagN) приводят к снижению или подавлению способности штамма индуцировать ИЛ-8 (7). Механизм индукции ИЛ-8 еще не раскрыт. Однако установлено, что некоторые гены cagPAI являются гомологами генов секреторного механизма IV типа, следовательно, этот регион кодирует секреторный механизм, участвующий в проявлении вирулентных детерминант (3).
В ряде исследований показано, что cagPAI может обнаруживаться как в виде одного непрерывного фрагмента, так и состоять из двух регионов, cagl и cagll, разделенных вставочной последовательностью IS605 или большим участком хромосомной ДНК, а также находиться в состоянии частичной делеции (9,10).
Вставочная последовательность IS605 может иметь место в любом локусе хромосомы Н.pylori и считается причастной к процессам реаранжировки генов Н.pylori (15). Высказывается предположение, что IS605 была приобретена Н.pylori эволюционно позже cagPAI и что наличие этой последовательности является необходимой предпосылкой для делеции cagPAI (3), что, однако, не подтверждается другими исследованиями (9,10,12). Противоречивы также исследования в отношении потенциальных маркеров cagPAI: если ранее таковым считался cagA, то в настоящее время доказана несостоятельность подобного подхода, и в качестве маркеров cagPAI предлагаются гены picB, virD4 (9,10), хотя ни один из этих маркеров не обеспечивает вероятности наличия cagPAI в 100% случаев (12). Поскольку cagPAI может подвергаться частичной делеции или находиться в различных формах организации, то выявление одного или даже нескольких генов недостаточно для доказательства наличия данного региона. Отсюда становятся понятными результаты исследований, полученные разными авторами, о несоответствии структуры cagPAI и клинических проявлений патологии, ассоциированной с Н.pylori-инфекцией (6,9,10). Результаты последних исследований (12) показывают, что способность Н.pylori индуцировать секрецию ИЛ-8 клетками линии НЕр-2 зависит от наличия целого cagPAI, как непрерывного, так и в виде двух регионов. Несмотря на то, что наличие функционирующего cagPAI усиливает провоспалительные свойства штамма Н.pylori, прогностическая ценность этого феномена в отношении развития тяжелой ассоциированной патологии может быть невелика, поскольку на развитие заболеваний влияют другие факторы (6). Audibert С., et al. (12) сообщают о возможности индукции секреции ИЛ-8 cagPAI-негативными штаммами Н.pylori, а также о существовании cagPAI-позитивных штаммов, неспособных индуцировать секрецию ИЛ-8. Следовательно, cagPAI или его отдельные компоненты не являются единственными элементами, необходимыми для индукции ИЛ-8. Yamaoka et al. (13) обнаружили, что cagPAI-негативные штаммы Н.pylori, содержащие ген НР0638, кодирующий один из 32 белков наружной мембраны, обладали более чем трехкратной продукцией ИЛ-8 по сравнению с cagPAI- негативными штаммами Н.pylori, содержащими нефункционирующий ген НР0638.
Таким образом, характеристика структуры cagPAI может оказаться полезной в определении вирулентности данного штамма Н.pylori, но недостаточна для определения характера клинического течения заболевания. Функционирование cag PAI приводит к увеличению интенсивности воспаления в СОЖ, зависящему от плотности обсемененности cagA(+) штаммов Н.pylori, однако, плотность обсемененности может определяться не вирулентными факторами микроорганизма, а факторами организма хозяина.
Популяционно-генетические исследования продемонстрировали важную роль рекомбинации в развитии генетического разнообразия и эволюции Н.pylori (20). В отношении cagPAI подобная гетерогенность показана в исследовании Akopyants et al. [7] описавших организацию cag PAI у штамма Н.pylori NCTC 11638. Авторы привели доказательства существования хромосомных реаранжировок с конечными точками cag PAI. Генетические рекомбинации у Н.pylori происходят настолько часто, что приводят к перемешиванию последовательностей ДНК и установлению связанного равновесия в популяции (так называемая панмиктическая популяционная структура), но клональные различия ("слабо клональные группировки") все же определяются. Существуют прямые доказательства развития рекомбинации у штаммов Н.pylori, колонизирующих человека, между двумя и более изолятами (20). Таким образом, горизонтальная передача генов между разными штаммами Н.pylori, сопровождающаяся частыми рекомбинациями ДНК, вносит существенный вклад в повышение полиморфизма среди популяций Н.pylori.
Микроорганизмы могут противостоять воздействию окружающей среды посредством изменения своего генетического материала (путем мутаций или горизонтального переноса генов). В отличие, например, от E.coli, регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у Н.pylori наблюдается реже; по-видимому, Н.pylori избирают путь мутаций ДНК в качестве стратегии адаптации к изменениям среды. Важным примером этой стратегии служит развитие антибиотикорезистентности. Несмотря на возможность эффективной трансформации Н.pylori при помощи генов резистентности, имеющихся у родственных видов in vitro, все клинические наблюдения резистентности являлись скорее результатом мутаций хромосомных генов, чем присоединением генов резистентности, имеющихся на плазмидах или транспозонах. 27 генов в геноме Н.pylori содержат простые нуклеотидные повторы, в их числе - гены, кодирующие наружные мембранные белки, компоненты для синтеза ЛПС и системы рестрикции/модификации ДНК. Эти простые повторяющиеся последовательности являются критическими точками для развития мутаций, поскольку мутации типа сдвигов рамок считывания легко возникают в этих участках путем феномена "проскальзывания" (20), Это обеспечивает Н.pylori механизм регуляции генной экспрессии с помощью частого включения/выключения определенных генов и дает микроорганизму избирательное преимущество при взаимодействии с организмом хозяина за счет простых фенотипических вариаций (фазовые вариации).
Гипотеза, согласно которой другой бактериальный фактор - ген iceA - обладает нозологической специфичностью, не подтверждена, и в настоящее время нет биологических или эпидемиологических доказательств роли iceA как вирулентного фактора при Н.pylori-ассоциированной патологии. Так же доказана ошибочность возможности использования генотипа vac А для прогноза развития ЯБ. Анализ данных, полученных во всем мире, показал, что генотип vacAsl (считавшийся маркером повышенной вирулентности штаммов) является суррогатом cag PAI - позитивности (6). Имеются основания полагать, что вирулентность представляет собой фактор, зависящий от организма хозяина. Длительность развития гастрита определенного типа не соответствует по времени развитию определенного заболевания (например, антральный гастрит и ЯДК). Более очевидна роль факторов среды (например, диетических), чем Н.pylori, в развитии определенного типа гастрита (6).
Вышеуказанные обстоятельства побудили нас к проведению настоящего исследования.
Цель исследования
Выявление возможной зависимости характера гастродуоденальной патологии от генетических особенностей инфицирующего штамма Н.pylori (наличия генотипа vacA/cagA) и от характера экспрессии генов вирулентности Н.pylori (наличия сывороточных антител к протеинам VacA и CagA).
Материал и методы
Исследование проведено в двух группах пациентов с H.pylori-асссоциированнными язвенной болезнью и гастритом.
В первой группе с помощью гистологического метода и полимеразной цепной реакции (ПЦР) были исследованы образцы СОЖ 49 пациентов в возрасте от 14 до 62 лет. Обследуемые пациенты были разделены на 3 группы: язвенная болезнь желудка (ЯБЖ) - 4 пациента (8,16%), ЯДК - 25 человек (51,02%), только гастрит - 20 пациентов (40,82%).
Пациенты подвергались эндоскопии с прицельной биопсией СОЖ из тела и антрального отдела. В гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином и по методу Гимзы, оценивали обсемененность Н.pylori, активность гастрита, степень адгезии микроорганизмов к эпителиальным клеткам СОЖ. Для постановки ПЦР обработку бипотатов проводили набором "Амплификационная тест-система на основе ПЦР для выделения Helicobacter pylori" производства "Ниармедик", Москва, с праймерами Vacl и 2 (для фрагмента vacA H.pylori размером 396 нуклеотидных пар), праймерами Cagl и 2 (для амплификации фрагмента гена cagA размером 400 нуклеотидных пар), по прилагаемой программе. Визуализацию продуктов ПЦР осуществляли методом электрофореза в 1,5% агарозном геле с фотографированием в ультрафиолетовом свете на черно-белую пленку и получением фотографического изображения продуктов ПЦР.
Вторую группу исследуемых составили 18 пациентов с H.pylori - ассоциированным гастритом. Помимо описанного выше гистологического исследования биоптатов СОЖ, в сыворотке крови пациентов методом Western blot определяли наличие специфических IgG к CagA (116кДа) и VacA (89кДа) -антигенам H.pylori. В качестве тест-системы применялся набор реагентов Helico Blot 2.0 (Genelabs Diagnostics). В зависимости от результатов серологического исследования инфицирующие микроорганизмы подразделялись нами на 4 серотипа: серотип I (CagA+; VacA+), серотип la (CagA+; VacA-), серотип Ib (CagA-; VacA+) и серотип II (CagA-; VacA-). Результаты Western blotting - анализа обрабатывались при помощи специальной программы AutoScan, позволяющей получать графическое изображение антигенного профиля инфицирующего микроорганизма с определением соответствующего серотипа.
Результаты
В первой группе исследуемых тип I H.pylori (cagA(+)vacA(+)) обнаружен у 43 человек (87,76%), тип II H.pylori (cagA(-)vacA(-)) выявлен у 6 пациентов (12,24%). При ЯБЖ отмечалась инфицированность исключительно H.pylori I типа. У всех групп пациентов (ЯБЖ, ЯБДК, гастрит) был диагностирован "эндоскопический" и "гистологический" гастрит (100%). Результаты гистологического исследования активности гастрита, бактериальной обсемененности и адгезии, представлены в таблице 1. Полученные результаты показывают, что достоверных различий в активности воспаления и обсемененности при разных типах H.pylori-инфекции замечено не было, в отличие от показателей адгезии в теле желудка, которые при H.pylori-инфекции I типа были достоверно выше, чем при инфицировании H.pylori II типа.
Гистологические и молекулярно-генетические сопоставления, проведенные в исследуемых группах пациентов (табл. 2), показали, что наименьшая степень активности гистологического гастрита наблюдалась в СОЖ тела и антрального отдела у пациентов с ЯБДК, инфицированных cagA(-)vacA(-) штаммами H.pylori, а минимальные показатели бактериальной обсемененности имели место в теле желудка у пациентов с ЯБЖ, инфицированных штаммами H.pylori I типа. Степень бактериальной адгезии к клетками желудочного эпителия оказалась минимальной у пациентов с ЯБДК, инфицированных штаммами H.pylori II типа, независимо от исследованного отдела желудка. Наибольшие значения показателей активности гастрита отмечены нами в антральном отделе у пациентов с гастритом, инфицированных штаммами H.pylori II типа, и у пациентов с ЯБЖ, инфицированных штаммами H.pylori I типа. Наивысшая степень бактериальной обсемененности отмечена нами в теле желудка у пациентов с гастритом, инфицированных штаммами H.pylori II типа. Самые высокие показатели адгезии микроорганизмов к желудочным эпителиоцитам обнаружены в антральном отделе желудка у пациентов с ЯБЖ. инфицированных штаммами Н.pylori II типа. При этом численные значения показателей активности гастрита, бактериальной обсемененности и адгезии, незначительно варьируя между группами и в зависимости от генетических характеристик инфицирующих штаммов Н.pylori, были весьма сходными, а их средние значения статистически недостоверными.
При исследовании второй группы пациентов с помощью Western blotting - анализа нами получены следующие результаты. Атрофические изменения СОЖ выявлены у 55,6% пациентов, из них у половины больных атрофические изменения оценены нами как слабые и у половины - как умеренные. Среди пациентов с атрофическими изменениями слизистой оболочки тела желудка, независимо от степени выраженности атрофии анти - CagA - антитела выявлены в 80% случаев, анти - VacA - в 60% случаев. При гистологическом исследовании образцов слизистой оболочки из антрального отдела желудка атрофические изменения выявлены у 66,7% пациентов, из них у 58,3% больных атрофические изменения оценены нами как слабые и у 41,7% - как умеренные. Среди пациентов со слабой атрофией слизистой оболочки антрального отдела желудка анти - CagA - антитела выявлены в 85,7% случаев, анти - VacA - в 71,4%. Среди пациентов с умеренной атрофией слизистой оболочки антрального отдела желудка анти - CagA - антитела выявлены в 80% случаев, анти - VacA - в 60%.
H.pylori I серотипа обнаруживались наиболее часто: у 55,5% обследованных пациентов, 1а серотипа - у 33,3% пациентов. Микроорганизмы Ib и II серотипов обнаруживались одинаково редко - каждый серотип выявлен в 5,6% случаев. Среди пациентов со слабой атрофией слизистой оболочки тела желудка у 40% выявлены сывороточные антитела к H.pylori I серотипа, у 40% - к H.pylori Ia серотипа и у 20% - к H.pylori II серотипа. Среди пациентов с умеренной атрофией слизистой оболочки тела желудка у 40% выявлены сывороточные антитела к H.pylori I серотипа, у 40% - к H.pylori Ia серотипа и у 20% - к H.pylori Ib серотипа. При гистологическом исследовании образцов слизистой оболочки из антрального отдела желудка атрофические изменения выявлены у 66,7% пациентов, из них у 58,3% больных атрофические изменения оценены нами как слабые и у 41,7% - как умеренные. Среди пациентов со слабой атрофией слизистой оболочки антрального отдела желудка 71,4% оказались инфицированными H.pylori I серотипа, 14,3% - H.pylori Ia серотипа и 14,3% - H.pylori II серотипа. Среди пациентов с умеренной атрофией слизистой оболочки антрального отдела желудка у 40% выявлены сывороточные антитела к H.pylori I серотипа, у 40% -к H.pylori Ia серотипа и у 20% - к H.pylori Ib серотипа. Данные о степени выраженности атрофии слизистой оболочки желудка у пациентов с хроническим гастритом, инфицированных различными серотипами H.pylori, представлены на рисунке 4.
Обсуждение
Таким образом, нами не выявлено различий в интенсивности воспалительной реакции, возникающей в разных отделах СОЖ у исследованных пациентов, а также в показателях бактериальной обсемененности и адгезии, независимо от вида H.pylori - ассоциированной гастродуоденальной патологии и от некоторых молекулярно-генетических характеристик инфицирующих штаммов H.pylori, а именно: наличия определенного генотипа vacA/cagA. Данные серологического исследования пациентов с H.pylori - ассоциированным гастритом свидетельствуют о более частом развитии атрофических изменений слизистой оболочки желудка у H.pylori - инфицированных пациентов с наличием в сыворотке крови антител класса IgG к цитотоксину VacA и цитотоксин-ассоциированному протеину CagA, что соответствует инфицированию H.pylori I, Ia и Ib серотипов. При сопоставлении результатов изучения двух групп пациентов становится очевидным отсутствие прямой взаимосвязи между генетическими характеристиками инфицирующего штамма H.pylori и развитием определенной нозологической формы поражения СОЖ.
Полученные нами данные позволяют прийти к заключению о том, что генотип vacA/cagA не является определяющим в проявлении микроорганизмами своих вирулентных и патогенных свойств, как это считалось ранее. Однако делать однозначные выводы из полученных результатов нам кажется несколько преждевременным. Нельзя забывать о комплексной структуре островка патогенности H.pylori и об уникальной способности данного микроорганизма к изменчивости на генетическом уровне. Ген cagA - лишь один из множества генов, составляющих cag PAI, и результаты последних данных, опубликованных по этому вопросу, показывают, что данный ген может не являться определяющим в отношении вирулентности и патогенности H.pylori с развитием определенной нозологической формы поражения гастродуоденальной зоны. Ряд исследований был посвящен попыткам корреляции клинических проявлений и cag PAI -статуса. Maeda et al. [9] определяли наличие генов cag PAI у изолятов H.pylori, полученных от пациентов из Японии. Все изученные штаммы содержали cagA независимо от клинического статуса. 59 из 63 штаммов имели все гены cag PAI. У оставшихся 4 штаммов cag PAI содержал частичные делеции, и отсутствовал CagA протеин. В другом сообщении 73 изолята H.pylori от французских пациентов исследовались на наличие отдельных генов cag PAI посредством ПЦР [10]. Из 64 cagA+ штаммов 89% содержали полностью cag PAI. У 8 штаммов имелись делеции в cag PAI. Yamaoka et al. [11] установили значительную вариабельность в последовательности 3? конца cagA гена у 155 изолятов от японских пациентов. Различия продуктов ПЦР достигали 171 пары оснований. Одна из групп штаммов, обладавших сходными последовательностями, значительно ассоциировалась с развитием РЖ.
В исследованиях, основанных на методах гибридизации [14] или сравнительного геномного анализа [15,16], обнаружено, что разные штаммы H.pylori обладают уникальными генами. Некоторые из них кодируют рестрикционные энзимы, следовательно, определенные штаммы H.pylori могут осуществлять свободную рекомбинацию между собственными геномами, в то время как другие штаммы не способны к такой рекомбинации, при несовместимости рестрикционно-модификационных систем между штаммами. В исследовании Suerbaum et al. [17] у 54 изученных штаммов H.pylori ни одна из последовательностей трех вирулентных генов (flaA, flaB, vacA) не совпадала на 100%. Achtman et al. [18] выявили высокую частоту рекомбинаций как среди вирулентных генов, так и среди генов домашнего хозяйства. С другой стороны, несмотря на беспрецедентно высокую способность к рекомбинации, штаммы Н.pylori являются генетически стабильными в течение короткого периода времени внутри семей и в определенных географических регионах [17,18]. Kersulyte et al. [19] получили прямое доказательство рекомбинации in vivo между cag(+) и cag(-) штаммами H.pylori, изолированными от одного и того же пациента; эта рекомбинация происходила в обоих направлениях. Утрата cag PAI cag(+) штаммами была обусловлена не эксцизией хромосомы в 37 kb регионе, но, скорее, рекомбинацией с ДНК cag(-) штаммов. In vivo происходящая рекомбинация между различными штаммами, инфицирующими одного пациента, может объяснить причину того, что некоторые штаммы H.pylori имеют только часть cag PAI, другие вообще не имеют, у остальных имеется полноценный островок патогенности. Результаты приведенных исследований показывают, что рекомбинация среди штаммов H.pylori происходит in vitro и in vivo, приводя к созданию новых генотипов, способных улучшать адаптацию H.pylori к условиям СОЖ посредством усиления колонизации или повышению устойчивости к иммунному ответу организма хозяина. Наличие уникальных для каждого штамма генов и возможность рекомбинации между штаммами in vivo может обусловливать широкий спектр клинических проявлений, колонизацию различных отделов желудка, особенности колонизации разных человеческих популяций.
Таким образом, H.pylori является наиболее генетически гетерогенным из известных микроорганизмов, а панмиктическая структура популяции H.pylori обусловливает различные клинические последствия инфицирования разными штаммами. Генетическая вариабельность имеет три основных источника: точечные мутации, появляющиеся в результате ошибок репликации в нормальных или поврежденных матрицах ДНК; смещение ДНК путем рекомбинации, которое часто опосредуется транспозонами и повторяющимися последовательностями; латеральный перенос генов от внешнего донора. Хотя не существует очевидных экспериментальных доказательств гипермутабельности Н. pylori, обширное число аллелей для патогенных генов, выявленное в клинических изолятах, позволяет считать мутации de novo главной причиной генетической неоднородности, наблюдаемой у данного микроорганизма. Это ведет к предположению, что у H.pylori имеется механизм постоянного или спорадического усиления мутагенеза.
Учитывая вышеизложенное, нам представляются возможными два варианта объяснения наблюдаемого отсутствия связи между cagA-статусом инфицирующего штамма H.pylori и интенсивностью ответной воспалительной реакции в СОЖ с развитием разных видов гастродуоденальной патологии на момент исследования пациента:
1) инфицировавшие штаммы H.pylori обладали генами островка cag PAI, что привело к развитию повреждения СОЖ и клинической картины гастродуоденальной патологии, однако при установлении колонизации, - точнее, при достижении вышеупомянутого связанного равновесия в популяции, - могла произойти реаранжировка островка патогенности, и штаммы стали cag - негативными (по результатам ПЦР на момент исследования), но морфологическая картина повреждения СОЖ в сочетании с серологическими данными (обнаружение в сыворотке крови антител класса IgG к цитотоксину VacA и цитотоксин-ассоциированному протеину CagA) продолжала наводить на мысль об инфицировании "высокопатогенными" штаммами H.pylori;
2) выявление cagA-позитивности/негативности штаммов H.pylori не имеет отношения к развитию более или менее серьезной гастродуоденальной патологии, поскольку в формировании ответной реакции организма хозяина принимают участие другие гены из состава островка патогенности, отличные от cagA.
Выводы
1. В развитии конкретной нозологической формы Н.pylori-ассоциированного повреждения СО гастродуоденальной зоны участвуют не только бактериальные факторы, но также велика роль факторов организма инфицированного хозяина. Этим объясняется развитие широкого спектра Н.pylori-ассоциированных заболеваний, начиная от бессимптомного носительства и заканчивая развитием злокачественных опухолей желудка, пищевода и 12-перстной кишки.
2. Высокая генетическая гетерогенность штаммов H.pylori может быть обусловлена высокой частотой генетических рекомбинаций между микроорганизмами в процессе длительной колонизации одного и того же хозяина, что создает противоречия в оценке роли некоторых факторов вирулентности (в нашем исследовании - vacA/cagA-позитив-ности) в развитии той или иной ассоциированной патологии и затрудняет использование ПЦР как с диагностической, так и с прогностической целью.
3. Диагностические исследования пациентов с Н.pylori-ассоциированной патологией обеспечивают получение информации, характеризующей состояние ответной реакции организма хозяина на момент исследования, при этом попытка характеристики вирулентных и патогенных свойств инфицирующих штаммов H.pylori может дать ложно-позитивные или ложно-негативные результаты, связанные с высокой вероятностью генетических рекомбинаций между штаммами.
ТАБЛИЦА 2
Гистологические и молекулярно-генетические сопоставления при H.pylori - ассоциированной гастродуоденальной патологии
ТАБЛИЦА 1
Показатели активности, обсемененности, адгезии в теле желудка и антральном отделе в зависимости от генетической характеристики H.pylori
Литература
1. McGee DJ, Mobley HIT. // Mechanisms of Helicobacter pylori infection: bacterial factors. - In: Gastroduodenal Disease and Helicobacter Pylori. Pathophysiology, Diagnosis and Treatment. /Edited by Westblom TU, Czinn SJ, Nedrud JG. - Berlin: Springer-Verlag. -1999. - P.155-180.
2. Suerbaum S, Hur C, Josenhans C, Michetti P. Pathogenesis and virulence factors of Helicobacter pylori. // Curr.Opin.Gastroenterol. -1999. - Vol.15 (suppl. 1). - P. S11-S18.
3. Covacci A., Telford J., Del Giudice G., Parsonnet J., Rappuoli R. Helicobacter pylori virulence and genetic geography. // Science. -1999. -Vol.284. - P.1328-1333.
4. Atherton JC, Tham KT, Peek RM, Cover TL, Blaser Ml Density of Helicobacter pylori infection in vivo as assessed by quantitative culture and histology. // J.Infect.Dis. -1996. - Vol.174. - P.552-6.
5. Yamaoka Y., Kodama Т., Kita M., et al. Relation between clinical presentation, Helicobacter pylori density, interleukin Ib and -8 production and cagA status. // Gut. -1999. - Vol.45. - P.804-11.
6. Graham DY, Yamaoka Y. Disease-specific Helicobacter pylori virulence factors: the unfulfilled promise. // Helicobacter. - 2000. -Vol.5 (suppl.l). - P.S3-S9.
7. Akopyants NS, Clifton SW, Kersulyte D, Crabtree JE, Youree BE, Reece CA, Bukanov NO, Drazek ES, Roe BA, Berg DE. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. // Mol Microbiol. -1998. - Vol. 28. - P.37-53.
8. Li SD, Kersulyte D, Lindley IJD, Neelam B, Berg DE, Crabtree JE. Multiple genes in the left half of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori are required for tyrosine kinase-dependent transcription of interleukin-8 in gastric epithelial cells. // Infect Immun. -1999. - Vol.67. - P.3893-3899.
9. Maeda S, Yoshida H, Ikenoue T, Ogura K, Kanai F, Kato N, Shiratori Y, Omata M. Structure of the cag pathogenicity island in Japanese Helicobacter pylori isolates. // Gut. -1999. - Vol.44. - P.336-341.
10. Jenks PJ, Megraud F, Labigne A. Clinical outcome after infection with Helicobacter pylori does not appear to be reliably predicted by the presence of any of the genes of the cag pathogenicity island. // Gut 1998. - Vol.43. - P.752-758.
11. Yamaoka Y, Kodama T, Kashima K, Graham DY, Sepulveda AR. Variants of the 3? region of the cagA gene in Helicobacter pylori isolates from patients with different H.pylori-associated diseases. // J Clin Microbiol. -1998. - Vol.36. - P.2258-2263.
12. Audibert C., Burucoa C., Janvier В., Fauchere J.L. Implication of the structure of the Helicobacter pylori cag pathogenicity island in induction of interleukin-8 secretion. // Infect Immun/ - 2001 -Vol.69, No.3. - P. 1625-1629.
13. Yamaoka Y, Kwon D, Graham D. A Mr 34.000 proinflammatory outer membrane protein (oipA) of Helicobacter pylori. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2000. - Vol.97. - P.7533-7538.
14. Akopyants NS, Fradkov A, Diatchenko L, Hill JE, Siebert PD, Lukyanov SA, Sverdlov ED, et al. PCR-based subtractive hybridization and differences in gene content among strains of Helicobacter pylori.//Proc Natl Acad Sci USA. -1998. -Vol.95. -P.13108-13113.
15. Aim R, Ling LS, Moir DT, King BL, Brown ED, Doig PC, Smith DR, et al. Genomic-sequence comparison of two unrelated isolates of the human gastric pathogen Helicobacter pylori. // Nature. -1999. - Vol.397 .-P.176-180.
16. Doig P, de Jonge BL, Aim RA, Brown ED, Uria-Nickelsen M, Noonan B, Mills SD, et al. Helicobacter pylori physiology predicted from genomic comparison of two strains. // Microbiol Mol Biol Rev. -1999. - Vol.63. - P.675-707.
17. Suerbaum S, Maynard Smith J, Bapumia K, Morelli G, Smith NH, Kunstmann E, Dyrek I, et al. Free recombination within Helicobacter pylori. // Proc Natl Acad Sci USA. - 1998. - Vol.95. -P.12619-12624.
18. Achtman M, Azuma T, Berg DE, Ito Y, Morelli G, Pan Z-J, Suerbaum S, et al. Recombination and clonal groupings within Helicobacter pylori from different geographical regions. // Mol Microbiol. -1999. - Vol.32. - P.459-470.
19. Kersulyte D, Chalkauskas H, Berg DE. Emergence of recombinant strains of Helicobacter pylori during human infection. // Mol Microbiol. -1999. - Vol.31. - P.31-43.
20. Ge Wang, M. Zafri Humayun and Diane E. Taylor. Mutation as an origin of genetic variability in Helicobacter pylori. // Trends In Microbiology. -1999. - Vol.7, No.12. - P.488-493.
© Copyright AMA Ltd. 2004.
Helicobacter pylori (H.pylori) является общепризнанным этиологическим агентом гастрита и пептической язвы и главным фактором риска развития желудочных аденокарцином и МАLТлимфом. Способность H.pylori обусловливать развитие перечисленных заболеваний зависит от факторов, относящихся к самому микроорганизму, организму хозяина и окружающей среде. Бактериальные факторы, обеспечивающие колонизацию слизистой оболочки желудка (СОЖ) H.pylori, включают уреазу, жгутики, адгезины, альфа-глутамилтранспептидазу. Липополисахариды, уреаза и вакуолизирующий цитотоксин являются факторами, обеспечивающими возможность H.pylori персистировать в организме хозяина в течение десятилетий и вызывать интенсивный воспалительный ответ, ведущий к повреждению клеток хозяина.
Патогенез H.pylori - инфекции у людей может быть представлен в виде трех этапов [1]:
1) поступление в просвет желудка, прикрепление к эпителию, колонизация СОЖ;
2) ускользание от иммунного ответа, нарушение или использование иммунной системы организма хозяина;
3) размножение, повреждение ткани, передача новому хозяину или распространение на соседние органы.
Фактор вирулентности определяется своим участием в одном или нескольких из этих процессов [1,2]. В настоящее время идентифицирован ряд факторов вирулентности H.pylori, включая бактериальные гены cagA, vacA, iceA. Однако, с другой стороны, накоплены убедительные данные о том, что ни один из этих факторов не имеет специфической связи с развитием определенного заболевания. Общепризнанно, что воспалительный ответ в СОЖ является ключом к пониманию механизмов, ведущих к развитию тяжелых заболеваний, ассоциированных с Н.pylori-инфекцией. Любой фактор, приводящий к усилению воспалительного ответа в СОЖ, может усиливать риск тяжелых последствий инфицирования.
Гены H.pylori в составе так называемого "островка патогенности" cag (cagA pathogenicity island, cag PAI) причастны к развитию воспалительного ответа путем инициации каскада сигнальных трансдукций, приводящего к продукции интерлейкина (ИЛ)-8. Ответная выработка провоспалительных цитокинов и клеточный (Th-1 - опосредованный) ответ приводят к дальнейшему прогрессированию воспалительной реакции. Активность ферментов NO-синтетазы (iNOS) и циклооксигеназы может нарушать баланс между процессами апоптоза желудочных эпителиоцитов и их пролиферацией, способствуя в первом случае изъязвлению СОЖ, а во втором - развитию опухолей. Th-1 - ответ организма хозяина и выработка анти-H.pylori антител не способствуют элиминации возбудителя, что вызывает проблемы при разработке иммунологических методов лечения и профилактики обсуждаемой патологии.
Несколько лет назад было высказано предположение, что плотность cagA (+) штаммов H.pylori в СОЖ значительно превышает плотность cagA (-) штаммов (4), и что различия в интенсивности воспалительной реакции, вызванной этими штаммами, в основном обусловлены разной степенью обсемененности СОЖ. В этом исследовании не проводилось сопоставление воспалительной реакции и клинических проявлений, и последующее изучение пациентов с Н.pylori-ассоциированным гастритом показало, что не существует различий в плотности обсемененности между cagA (+) и cagA (-) -штаммами (5). Напротив, плотность обсемененности антральной СОЖ при Н.pylori-ассоциированной язвенной болезни 12-перстной кишки (ЯДК) значительно выше, чем при антральном гастрите. В упомянутом исследовании Atherton и соавт (4) большинство cagA (+) штаммов H.pylori были изолированы от пациентов с ЯДК, что дало основание предположить, что высокая плотность обсемененности cagA (+) штаммов обусловлена самим заболеванием, а не cagA - статусом. Yamaoka Y., et al. (5) установили, что обсемененность cagA (+) H.pylori в теле желудка была ниже при ЯДК, чем при гастрите, следовательно, критическим фактором для колонизации СОЖ H.pylori могут оказаться факторы организма хозяина, вероятнее всего, кислотная секреция. Те же авторы исследовали продукцию ИЛ-8 у пациентов с ЯДК в сравнении с пациентами, страдавшими только гастритом. Средняя концентрация ИЛ-8 в антральном отделе желудка оказалась выше у пациентов с ЯДК. Однако при сравнительной оценке числа микроорганизмов продукция ИЛ-8 оказалась одинаковой, независимо от вида патологии, как in vivo, так и in vitro.
В генетических исследованиях показано участие генов cag PAI в индукции секреции ИЛ-8 человеческими клетками, колонизированными Н.pylori. Этот феномен может быть обусловлен провоспалительными свойствами штамма, а, следовательно, его вирулентностью. Штаммы Н.pylori, индуцирующие секрецию ИЛ-8, действительно ассоциируются с наличием гена cagA и тяжелой патологии, хотя недавно эти данные были оспорены (9,10). При изучении cag PAI оказалось, что его неоднородность касается не только структурной организации, но и функциональной активности. В отношении повреждения СОЖ это проявляется, прежде всего, неодинаковым участием компонентов cag PAI в индукции образования ИЛ-8. Li et al. [8] обнаружили, что гены левой половины PAI (гомологи генов virB9, virBlO, и virBll, описанных у микроорганизмов рода Agrobacterium) аннулировали индукцию ИЛ-8. Индукция ИЛ-8 устраняется при нарушении структуры генов cag PAI: cagE, G, H, I, L, M. В то же время cagA, cagF, cagN, по данным авторов, не являются необходимыми для индукции ИЛ-8.
Точечные мутации большинства генов обсуждаемого региона (за исключением cagA и cagN) приводят к снижению или подавлению способности штамма индуцировать ИЛ-8 (7). Механизм индукции ИЛ-8 еще не раскрыт. Однако установлено, что некоторые гены cagPAI являются гомологами генов секреторного механизма IV типа, следовательно, этот регион кодирует секреторный механизм, участвующий в проявлении вирулентных детерминант (3).
В ряде исследований показано, что cagPAI может обнаруживаться как в виде одного непрерывного фрагмента, так и состоять из двух регионов, cagl и cagll, разделенных вставочной последовательностью IS605 или большим участком хромосомной ДНК, а также находиться в состоянии частичной делеции (9,10).
Вставочная последовательность IS605 может иметь место в любом локусе хромосомы Н.pylori и считается причастной к процессам реаранжировки генов Н.pylori (15). Высказывается предположение, что IS605 была приобретена Н.pylori эволюционно позже cagPAI и что наличие этой последовательности является необходимой предпосылкой для делеции cagPAI (3), что, однако, не подтверждается другими исследованиями (9,10,12). Противоречивы также исследования в отношении потенциальных маркеров cagPAI: если ранее таковым считался cagA, то в настоящее время доказана несостоятельность подобного подхода, и в качестве маркеров cagPAI предлагаются гены picB, virD4 (9,10), хотя ни один из этих маркеров не обеспечивает вероятности наличия cagPAI в 100% случаев (12). Поскольку cagPAI может подвергаться частичной делеции или находиться в различных формах организации, то выявление одного или даже нескольких генов недостаточно для доказательства наличия данного региона. Отсюда становятся понятными результаты исследований, полученные разными авторами, о несоответствии структуры cagPAI и клинических проявлений патологии, ассоциированной с Н.pylori-инфекцией (6,9,10). Результаты последних исследований (12) показывают, что способность Н.pylori индуцировать секрецию ИЛ-8 клетками линии НЕр-2 зависит от наличия целого cagPAI, как непрерывного, так и в виде двух регионов. Несмотря на то, что наличие функционирующего cagPAI усиливает провоспалительные свойства штамма Н.pylori, прогностическая ценность этого феномена в отношении развития тяжелой ассоциированной патологии может быть невелика, поскольку на развитие заболеваний влияют другие факторы (6). Audibert С., et al. (12) сообщают о возможности индукции секреции ИЛ-8 cagPAI-негативными штаммами Н.pylori, а также о существовании cagPAI-позитивных штаммов, неспособных индуцировать секрецию ИЛ-8. Следовательно, cagPAI или его отдельные компоненты не являются единственными элементами, необходимыми для индукции ИЛ-8. Yamaoka et al. (13) обнаружили, что cagPAI-негативные штаммы Н.pylori, содержащие ген НР0638, кодирующий один из 32 белков наружной мембраны, обладали более чем трехкратной продукцией ИЛ-8 по сравнению с cagPAI- негативными штаммами Н.pylori, содержащими нефункционирующий ген НР0638.
Таким образом, характеристика структуры cagPAI может оказаться полезной в определении вирулентности данного штамма Н.pylori, но недостаточна для определения характера клинического течения заболевания. Функционирование cag PAI приводит к увеличению интенсивности воспаления в СОЖ, зависящему от плотности обсемененности cagA(+) штаммов Н.pylori, однако, плотность обсемененности может определяться не вирулентными факторами микроорганизма, а факторами организма хозяина.
Популяционно-генетические исследования продемонстрировали важную роль рекомбинации в развитии генетического разнообразия и эволюции Н.pylori (20). В отношении cagPAI подобная гетерогенность показана в исследовании Akopyants et al. [7] описавших организацию cag PAI у штамма Н.pylori NCTC 11638. Авторы привели доказательства существования хромосомных реаранжировок с конечными точками cag PAI. Генетические рекомбинации у Н.pylori происходят настолько часто, что приводят к перемешиванию последовательностей ДНК и установлению связанного равновесия в популяции (так называемая панмиктическая популяционная структура), но клональные различия ("слабо клональные группировки") все же определяются. Существуют прямые доказательства развития рекомбинации у штаммов Н.pylori, колонизирующих человека, между двумя и более изолятами (20). Таким образом, горизонтальная передача генов между разными штаммами Н.pylori, сопровождающаяся частыми рекомбинациями ДНК, вносит существенный вклад в повышение полиморфизма среди популяций Н.pylori.
Микроорганизмы могут противостоять воздействию окружающей среды посредством изменения своего генетического материала (путем мутаций или горизонтального переноса генов). В отличие, например, от E.coli, регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у Н.pylori наблюдается реже; по-видимому, Н.pylori избирают путь мутаций ДНК в качестве стратегии адаптации к изменениям среды. Важным примером этой стратегии служит развитие антибиотикорезистентности. Несмотря на возможность эффективной трансформации Н.pylori при помощи генов резистентности, имеющихся у родственных видов in vitro, все клинические наблюдения резистентности являлись скорее результатом мутаций хромосомных генов, чем присоединением генов резистентности, имеющихся на плазмидах или транспозонах. 27 генов в геноме Н.pylori содержат простые нуклеотидные повторы, в их числе - гены, кодирующие наружные мембранные белки, компоненты для синтеза ЛПС и системы рестрикции/модификации ДНК. Эти простые повторяющиеся последовательности являются критическими точками для развития мутаций, поскольку мутации типа сдвигов рамок считывания легко возникают в этих участках путем феномена "проскальзывания" (20), Это обеспечивает Н.pylori механизм регуляции генной экспрессии с помощью частого включения/выключения определенных генов и дает микроорганизму избирательное преимущество при взаимодействии с организмом хозяина за счет простых фенотипических вариаций (фазовые вариации).
Гипотеза, согласно которой другой бактериальный фактор - ген iceA - обладает нозологической специфичностью, не подтверждена, и в настоящее время нет биологических или эпидемиологических доказательств роли iceA как вирулентного фактора при Н.pylori-ассоциированной патологии. Так же доказана ошибочность возможности использования генотипа vac А для прогноза развития ЯБ. Анализ данных, полученных во всем мире, показал, что генотип vacAsl (считавшийся маркером повышенной вирулентности штаммов) является суррогатом cag PAI - позитивности (6). Имеются основания полагать, что вирулентность представляет собой фактор, зависящий от организма хозяина. Длительность развития гастрита определенного типа не соответствует по времени развитию определенного заболевания (например, антральный гастрит и ЯДК). Более очевидна роль факторов среды (например, диетических), чем Н.pylori, в развитии определенного типа гастрита (6).
Вышеуказанные обстоятельства побудили нас к проведению настоящего исследования.
Цель исследования
Выявление возможной зависимости характера гастродуоденальной патологии от генетических особенностей инфицирующего штамма Н.pylori (наличия генотипа vacA/cagA) и от характера экспрессии генов вирулентности Н.pylori (наличия сывороточных антител к протеинам VacA и CagA).
Материал и методы
Исследование проведено в двух группах пациентов с H.pylori-асссоциированнными язвенной болезнью и гастритом.
В первой группе с помощью гистологического метода и полимеразной цепной реакции (ПЦР) были исследованы образцы СОЖ 49 пациентов в возрасте от 14 до 62 лет. Обследуемые пациенты были разделены на 3 группы: язвенная болезнь желудка (ЯБЖ) - 4 пациента (8,16%), ЯДК - 25 человек (51,02%), только гастрит - 20 пациентов (40,82%).
Пациенты подвергались эндоскопии с прицельной биопсией СОЖ из тела и антрального отдела. В гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином и по методу Гимзы, оценивали обсемененность Н.pylori, активность гастрита, степень адгезии микроорганизмов к эпителиальным клеткам СОЖ. Для постановки ПЦР обработку бипотатов проводили набором "Амплификационная тест-система на основе ПЦР для выделения Helicobacter pylori" производства "Ниармедик", Москва, с праймерами Vacl и 2 (для фрагмента vacA H.pylori размером 396 нуклеотидных пар), праймерами Cagl и 2 (для амплификации фрагмента гена cagA размером 400 нуклеотидных пар), по прилагаемой программе. Визуализацию продуктов ПЦР осуществляли методом электрофореза в 1,5% агарозном геле с фотографированием в ультрафиолетовом свете на черно-белую пленку и получением фотографического изображения продуктов ПЦР.
Вторую группу исследуемых составили 18 пациентов с H.pylori - ассоциированным гастритом. Помимо описанного выше гистологического исследования биоптатов СОЖ, в сыворотке крови пациентов методом Western blot определяли наличие специфических IgG к CagA (116кДа) и VacA (89кДа) -антигенам H.pylori. В качестве тест-системы применялся набор реагентов Helico Blot 2.0 (Genelabs Diagnostics). В зависимости от результатов серологического исследования инфицирующие микроорганизмы подразделялись нами на 4 серотипа: серотип I (CagA+; VacA+), серотип la (CagA+; VacA-), серотип Ib (CagA-; VacA+) и серотип II (CagA-; VacA-). Результаты Western blotting - анализа обрабатывались при помощи специальной программы AutoScan, позволяющей получать графическое изображение антигенного профиля инфицирующего микроорганизма с определением соответствующего серотипа.
Результаты
В первой группе исследуемых тип I H.pylori (cagA(+)vacA(+)) обнаружен у 43 человек (87,76%), тип II H.pylori (cagA(-)vacA(-)) выявлен у 6 пациентов (12,24%). При ЯБЖ отмечалась инфицированность исключительно H.pylori I типа. У всех групп пациентов (ЯБЖ, ЯБДК, гастрит) был диагностирован "эндоскопический" и "гистологический" гастрит (100%). Результаты гистологического исследования активности гастрита, бактериальной обсемененности и адгезии, представлены в таблице 1. Полученные результаты показывают, что достоверных различий в активности воспаления и обсемененности при разных типах H.pylori-инфекции замечено не было, в отличие от показателей адгезии в теле желудка, которые при H.pylori-инфекции I типа были достоверно выше, чем при инфицировании H.pylori II типа.
Гистологические и молекулярно-генетические сопоставления, проведенные в исследуемых группах пациентов (табл. 2), показали, что наименьшая степень активности гистологического гастрита наблюдалась в СОЖ тела и антрального отдела у пациентов с ЯБДК, инфицированных cagA(-)vacA(-) штаммами H.pylori, а минимальные показатели бактериальной обсемененности имели место в теле желудка у пациентов с ЯБЖ, инфицированных штаммами H.pylori I типа. Степень бактериальной адгезии к клетками желудочного эпителия оказалась минимальной у пациентов с ЯБДК, инфицированных штаммами H.pylori II типа, независимо от исследованного отдела желудка. Наибольшие значения показателей активности гастрита отмечены нами в антральном отделе у пациентов с гастритом, инфицированных штаммами H.pylori II типа, и у пациентов с ЯБЖ, инфицированных штаммами H.pylori I типа. Наивысшая степень бактериальной обсемененности отмечена нами в теле желудка у пациентов с гастритом, инфицированных штаммами H.pylori II типа. Самые высокие показатели адгезии микроорганизмов к желудочным эпителиоцитам обнаружены в антральном отделе желудка у пациентов с ЯБЖ. инфицированных штаммами Н.pylori II типа. При этом численные значения показателей активности гастрита, бактериальной обсемененности и адгезии, незначительно варьируя между группами и в зависимости от генетических характеристик инфицирующих штаммов Н.pylori, были весьма сходными, а их средние значения статистически недостоверными.
При исследовании второй группы пациентов с помощью Western blotting - анализа нами получены следующие результаты. Атрофические изменения СОЖ выявлены у 55,6% пациентов, из них у половины больных атрофические изменения оценены нами как слабые и у половины - как умеренные. Среди пациентов с атрофическими изменениями слизистой оболочки тела желудка, независимо от степени выраженности атрофии анти - CagA - антитела выявлены в 80% случаев, анти - VacA - в 60% случаев. При гистологическом исследовании образцов слизистой оболочки из антрального отдела желудка атрофические изменения выявлены у 66,7% пациентов, из них у 58,3% больных атрофические изменения оценены нами как слабые и у 41,7% - как умеренные. Среди пациентов со слабой атрофией слизистой оболочки антрального отдела желудка анти - CagA - антитела выявлены в 85,7% случаев, анти - VacA - в 71,4%. Среди пациентов с умеренной атрофией слизистой оболочки антрального отдела желудка анти - CagA - антитела выявлены в 80% случаев, анти - VacA - в 60%.
H.pylori I серотипа обнаруживались наиболее часто: у 55,5% обследованных пациентов, 1а серотипа - у 33,3% пациентов. Микроорганизмы Ib и II серотипов обнаруживались одинаково редко - каждый серотип выявлен в 5,6% случаев. Среди пациентов со слабой атрофией слизистой оболочки тела желудка у 40% выявлены сывороточные антитела к H.pylori I серотипа, у 40% - к H.pylori Ia серотипа и у 20% - к H.pylori II серотипа. Среди пациентов с умеренной атрофией слизистой оболочки тела желудка у 40% выявлены сывороточные антитела к H.pylori I серотипа, у 40% - к H.pylori Ia серотипа и у 20% - к H.pylori Ib серотипа. При гистологическом исследовании образцов слизистой оболочки из антрального отдела желудка атрофические изменения выявлены у 66,7% пациентов, из них у 58,3% больных атрофические изменения оценены нами как слабые и у 41,7% - как умеренные. Среди пациентов со слабой атрофией слизистой оболочки антрального отдела желудка 71,4% оказались инфицированными H.pylori I серотипа, 14,3% - H.pylori Ia серотипа и 14,3% - H.pylori II серотипа. Среди пациентов с умеренной атрофией слизистой оболочки антрального отдела желудка у 40% выявлены сывороточные антитела к H.pylori I серотипа, у 40% -к H.pylori Ia серотипа и у 20% - к H.pylori Ib серотипа. Данные о степени выраженности атрофии слизистой оболочки желудка у пациентов с хроническим гастритом, инфицированных различными серотипами H.pylori, представлены на рисунке 4.
Обсуждение
Таким образом, нами не выявлено различий в интенсивности воспалительной реакции, возникающей в разных отделах СОЖ у исследованных пациентов, а также в показателях бактериальной обсемененности и адгезии, независимо от вида H.pylori - ассоциированной гастродуоденальной патологии и от некоторых молекулярно-генетических характеристик инфицирующих штаммов H.pylori, а именно: наличия определенного генотипа vacA/cagA. Данные серологического исследования пациентов с H.pylori - ассоциированным гастритом свидетельствуют о более частом развитии атрофических изменений слизистой оболочки желудка у H.pylori - инфицированных пациентов с наличием в сыворотке крови антител класса IgG к цитотоксину VacA и цитотоксин-ассоциированному протеину CagA, что соответствует инфицированию H.pylori I, Ia и Ib серотипов. При сопоставлении результатов изучения двух групп пациентов становится очевидным отсутствие прямой взаимосвязи между генетическими характеристиками инфицирующего штамма H.pylori и развитием определенной нозологической формы поражения СОЖ.
Полученные нами данные позволяют прийти к заключению о том, что генотип vacA/cagA не является определяющим в проявлении микроорганизмами своих вирулентных и патогенных свойств, как это считалось ранее. Однако делать однозначные выводы из полученных результатов нам кажется несколько преждевременным. Нельзя забывать о комплексной структуре островка патогенности H.pylori и об уникальной способности данного микроорганизма к изменчивости на генетическом уровне. Ген cagA - лишь один из множества генов, составляющих cag PAI, и результаты последних данных, опубликованных по этому вопросу, показывают, что данный ген может не являться определяющим в отношении вирулентности и патогенности H.pylori с развитием определенной нозологической формы поражения гастродуоденальной зоны. Ряд исследований был посвящен попыткам корреляции клинических проявлений и cag PAI -статуса. Maeda et al. [9] определяли наличие генов cag PAI у изолятов H.pylori, полученных от пациентов из Японии. Все изученные штаммы содержали cagA независимо от клинического статуса. 59 из 63 штаммов имели все гены cag PAI. У оставшихся 4 штаммов cag PAI содержал частичные делеции, и отсутствовал CagA протеин. В другом сообщении 73 изолята H.pylori от французских пациентов исследовались на наличие отдельных генов cag PAI посредством ПЦР [10]. Из 64 cagA+ штаммов 89% содержали полностью cag PAI. У 8 штаммов имелись делеции в cag PAI. Yamaoka et al. [11] установили значительную вариабельность в последовательности 3? конца cagA гена у 155 изолятов от японских пациентов. Различия продуктов ПЦР достигали 171 пары оснований. Одна из групп штаммов, обладавших сходными последовательностями, значительно ассоциировалась с развитием РЖ.
В исследованиях, основанных на методах гибридизации [14] или сравнительного геномного анализа [15,16], обнаружено, что разные штаммы H.pylori обладают уникальными генами. Некоторые из них кодируют рестрикционные энзимы, следовательно, определенные штаммы H.pylori могут осуществлять свободную рекомбинацию между собственными геномами, в то время как другие штаммы не способны к такой рекомбинации, при несовместимости рестрикционно-модификационных систем между штаммами. В исследовании Suerbaum et al. [17] у 54 изученных штаммов H.pylori ни одна из последовательностей трех вирулентных генов (flaA, flaB, vacA) не совпадала на 100%. Achtman et al. [18] выявили высокую частоту рекомбинаций как среди вирулентных генов, так и среди генов домашнего хозяйства. С другой стороны, несмотря на беспрецедентно высокую способность к рекомбинации, штаммы Н.pylori являются генетически стабильными в течение короткого периода времени внутри семей и в определенных географических регионах [17,18]. Kersulyte et al. [19] получили прямое доказательство рекомбинации in vivo между cag(+) и cag(-) штаммами H.pylori, изолированными от одного и того же пациента; эта рекомбинация происходила в обоих направлениях. Утрата cag PAI cag(+) штаммами была обусловлена не эксцизией хромосомы в 37 kb регионе, но, скорее, рекомбинацией с ДНК cag(-) штаммов. In vivo происходящая рекомбинация между различными штаммами, инфицирующими одного пациента, может объяснить причину того, что некоторые штаммы H.pylori имеют только часть cag PAI, другие вообще не имеют, у остальных имеется полноценный островок патогенности. Результаты приведенных исследований показывают, что рекомбинация среди штаммов H.pylori происходит in vitro и in vivo, приводя к созданию новых генотипов, способных улучшать адаптацию H.pylori к условиям СОЖ посредством усиления колонизации или повышению устойчивости к иммунному ответу организма хозяина. Наличие уникальных для каждого штамма генов и возможность рекомбинации между штаммами in vivo может обусловливать широкий спектр клинических проявлений, колонизацию различных отделов желудка, особенности колонизации разных человеческих популяций.
Таким образом, H.pylori является наиболее генетически гетерогенным из известных микроорганизмов, а панмиктическая структура популяции H.pylori обусловливает различные клинические последствия инфицирования разными штаммами. Генетическая вариабельность имеет три основных источника: точечные мутации, появляющиеся в результате ошибок репликации в нормальных или поврежденных матрицах ДНК; смещение ДНК путем рекомбинации, которое часто опосредуется транспозонами и повторяющимися последовательностями; латеральный перенос генов от внешнего донора. Хотя не существует очевидных экспериментальных доказательств гипермутабельности Н. pylori, обширное число аллелей для патогенных генов, выявленное в клинических изолятах, позволяет считать мутации de novo главной причиной генетической неоднородности, наблюдаемой у данного микроорганизма. Это ведет к предположению, что у H.pylori имеется механизм постоянного или спорадического усиления мутагенеза.
Учитывая вышеизложенное, нам представляются возможными два варианта объяснения наблюдаемого отсутствия связи между cagA-статусом инфицирующего штамма H.pylori и интенсивностью ответной воспалительной реакции в СОЖ с развитием разных видов гастродуоденальной патологии на момент исследования пациента:
1) инфицировавшие штаммы H.pylori обладали генами островка cag PAI, что привело к развитию повреждения СОЖ и клинической картины гастродуоденальной патологии, однако при установлении колонизации, - точнее, при достижении вышеупомянутого связанного равновесия в популяции, - могла произойти реаранжировка островка патогенности, и штаммы стали cag - негативными (по результатам ПЦР на момент исследования), но морфологическая картина повреждения СОЖ в сочетании с серологическими данными (обнаружение в сыворотке крови антител класса IgG к цитотоксину VacA и цитотоксин-ассоциированному протеину CagA) продолжала наводить на мысль об инфицировании "высокопатогенными" штаммами H.pylori;
2) выявление cagA-позитивности/негативности штаммов H.pylori не имеет отношения к развитию более или менее серьезной гастродуоденальной патологии, поскольку в формировании ответной реакции организма хозяина принимают участие другие гены из состава островка патогенности, отличные от cagA.
Выводы
1. В развитии конкретной нозологической формы Н.pylori-ассоциированного повреждения СО гастродуоденальной зоны участвуют не только бактериальные факторы, но также велика роль факторов организма инфицированного хозяина. Этим объясняется развитие широкого спектра Н.pylori-ассоциированных заболеваний, начиная от бессимптомного носительства и заканчивая развитием злокачественных опухолей желудка, пищевода и 12-перстной кишки.
2. Высокая генетическая гетерогенность штаммов H.pylori может быть обусловлена высокой частотой генетических рекомбинаций между микроорганизмами в процессе длительной колонизации одного и того же хозяина, что создает противоречия в оценке роли некоторых факторов вирулентности (в нашем исследовании - vacA/cagA-позитив-ности) в развитии той или иной ассоциированной патологии и затрудняет использование ПЦР как с диагностической, так и с прогностической целью.
3. Диагностические исследования пациентов с Н.pylori-ассоциированной патологией обеспечивают получение информации, характеризующей состояние ответной реакции организма хозяина на момент исследования, при этом попытка характеристики вирулентных и патогенных свойств инфицирующих штаммов H.pylori может дать ложно-позитивные или ложно-негативные результаты, связанные с высокой вероятностью генетических рекомбинаций между штаммами.
ТАБЛИЦА 2
Гистологические и молекулярно-генетические сопоставления при H.pylori - ассоциированной гастродуоденальной патологии
| Патология: | Гастрит | ЯБЖ | ЯБДК | |||||
| Отдел |
Всего (n=20) | Тип I H.pylori (n=17) |
Тип II H.pylori (n=3) |
Всего (n=4) Тип I H.pylori (n=4) |
Всего (n=25) |
Тип I H.pylori (n=22) |
Тип II H.pylori (n=3) |
|
| Тело | активность гастрита |
|||||||
| Степень обсемененности |
||||||||
| Степень адгезии | ||||||||
отдел |
активность гастрита |
|||||||
| Степень обсемененности |
||||||||
| Степень адгезии | ||||||||
ТАБЛИЦА 1
Показатели активности, обсемененности, адгезии в теле желудка и антральном отделе в зависимости от генетической характеристики H.pylori
Показатели |
p | |||
| Активность | Тело | p>0,05 | ||
| Антрум | ||||
| Тело | p>0,05 | |||
| Антрум | p>0,05 | |||
| Адгезия | Тело | p>0,01 | ||
| Антрум | p>0,05 |
Литература
1. McGee DJ, Mobley HIT. // Mechanisms of Helicobacter pylori infection: bacterial factors. - In: Gastroduodenal Disease and Helicobacter Pylori. Pathophysiology, Diagnosis and Treatment. /Edited by Westblom TU, Czinn SJ, Nedrud JG. - Berlin: Springer-Verlag. -1999. - P.155-180.
2. Suerbaum S, Hur C, Josenhans C, Michetti P. Pathogenesis and virulence factors of Helicobacter pylori. // Curr.Opin.Gastroenterol. -1999. - Vol.15 (suppl. 1). - P. S11-S18.
3. Covacci A., Telford J., Del Giudice G., Parsonnet J., Rappuoli R. Helicobacter pylori virulence and genetic geography. // Science. -1999. -Vol.284. - P.1328-1333.
4. Atherton JC, Tham KT, Peek RM, Cover TL, Blaser Ml Density of Helicobacter pylori infection in vivo as assessed by quantitative culture and histology. // J.Infect.Dis. -1996. - Vol.174. - P.552-6.
5. Yamaoka Y., Kodama Т., Kita M., et al. Relation between clinical presentation, Helicobacter pylori density, interleukin Ib and -8 production and cagA status. // Gut. -1999. - Vol.45. - P.804-11.
6. Graham DY, Yamaoka Y. Disease-specific Helicobacter pylori virulence factors: the unfulfilled promise. // Helicobacter. - 2000. -Vol.5 (suppl.l). - P.S3-S9.
7. Akopyants NS, Clifton SW, Kersulyte D, Crabtree JE, Youree BE, Reece CA, Bukanov NO, Drazek ES, Roe BA, Berg DE. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. // Mol Microbiol. -1998. - Vol. 28. - P.37-53.
8. Li SD, Kersulyte D, Lindley IJD, Neelam B, Berg DE, Crabtree JE. Multiple genes in the left half of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori are required for tyrosine kinase-dependent transcription of interleukin-8 in gastric epithelial cells. // Infect Immun. -1999. - Vol.67. - P.3893-3899.
9. Maeda S, Yoshida H, Ikenoue T, Ogura K, Kanai F, Kato N, Shiratori Y, Omata M. Structure of the cag pathogenicity island in Japanese Helicobacter pylori isolates. // Gut. -1999. - Vol.44. - P.336-341.
10. Jenks PJ, Megraud F, Labigne A. Clinical outcome after infection with Helicobacter pylori does not appear to be reliably predicted by the presence of any of the genes of the cag pathogenicity island. // Gut 1998. - Vol.43. - P.752-758.
11. Yamaoka Y, Kodama T, Kashima K, Graham DY, Sepulveda AR. Variants of the 3? region of the cagA gene in Helicobacter pylori isolates from patients with different H.pylori-associated diseases. // J Clin Microbiol. -1998. - Vol.36. - P.2258-2263.
12. Audibert C., Burucoa C., Janvier В., Fauchere J.L. Implication of the structure of the Helicobacter pylori cag pathogenicity island in induction of interleukin-8 secretion. // Infect Immun/ - 2001 -Vol.69, No.3. - P. 1625-1629.
13. Yamaoka Y, Kwon D, Graham D. A Mr 34.000 proinflammatory outer membrane protein (oipA) of Helicobacter pylori. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2000. - Vol.97. - P.7533-7538.
14. Akopyants NS, Fradkov A, Diatchenko L, Hill JE, Siebert PD, Lukyanov SA, Sverdlov ED, et al. PCR-based subtractive hybridization and differences in gene content among strains of Helicobacter pylori.//Proc Natl Acad Sci USA. -1998. -Vol.95. -P.13108-13113.
15. Aim R, Ling LS, Moir DT, King BL, Brown ED, Doig PC, Smith DR, et al. Genomic-sequence comparison of two unrelated isolates of the human gastric pathogen Helicobacter pylori. // Nature. -1999. - Vol.397 .-P.176-180.
16. Doig P, de Jonge BL, Aim RA, Brown ED, Uria-Nickelsen M, Noonan B, Mills SD, et al. Helicobacter pylori physiology predicted from genomic comparison of two strains. // Microbiol Mol Biol Rev. -1999. - Vol.63. - P.675-707.
17. Suerbaum S, Maynard Smith J, Bapumia K, Morelli G, Smith NH, Kunstmann E, Dyrek I, et al. Free recombination within Helicobacter pylori. // Proc Natl Acad Sci USA. - 1998. - Vol.95. -P.12619-12624.
18. Achtman M, Azuma T, Berg DE, Ito Y, Morelli G, Pan Z-J, Suerbaum S, et al. Recombination and clonal groupings within Helicobacter pylori from different geographical regions. // Mol Microbiol. -1999. - Vol.32. - P.459-470.
19. Kersulyte D, Chalkauskas H, Berg DE. Emergence of recombinant strains of Helicobacter pylori during human infection. // Mol Microbiol. -1999. - Vol.31. - P.31-43.
20. Ge Wang, M. Zafri Humayun and Diane E. Taylor. Mutation as an origin of genetic variability in Helicobacter pylori. // Trends In Microbiology. -1999. - Vol.7, No.12. - P.488-493.
© Copyright AMA Ltd. 2004.